RNA结合蛋白PTBP1促进骨肉瘤恶性生物学行为的机制研究

来源 :中国人民解放军海军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qzhair
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研究背景骨肉瘤(OS;Osteosarcoma)是一种最常见的来源于间叶组织的,以形成骨或骨样组织为特征的骨原发恶性肿瘤,具有恶性程度高、早期转移、进展迅速等特点。于青少年及60~70岁老年人中最为常见,好发于四肢长骨干骺端附近。目前穿刺活检明确诊断、新辅助化疗、再行手术治疗,并根据肿瘤病理结果强化化疗的治疗模式已经成为骨肉瘤治疗的标准化方案,使得新发骨肉瘤患者5年总生存率提高到了68%,但已转移或复发的骨肉瘤患者其预后仍然较差。骨肉瘤目前病因未明,现有研究从肿瘤中鉴定出以TP53为代表的多基因突变,同时相关遗传疾病患者中骨肉瘤发病率也显著升高,揭示了骨肉瘤发生发展中基因层面的复杂性。由于骨肉瘤患者表现出的复杂而又广泛的异质性以及高度的恶性生物学行为,识别新的治疗靶点对于形成新的治疗方法基础仍然是具有挑战并且有迫切的需求。多嘧啶束结合蛋白1(PTBP1;Polypyrimidine Tract-Binding Protein 1)是一种广泛表达的RNA结合蛋白(RBP;RNA Binding Protien),参与RNA的成熟、转运、定位以及翻译,其最广泛的生理作用是作为剪接因子参与调节前m RNA的可变剪接(AS;Alternative Splicing)。PTBP1的表达失调也与多种肿瘤的发生发展密切相关。此外,PTBP1可以通过调控AS事件影响细胞周期、分化、代谢、运动及免疫等多方面。其可通过AS调控在多种肿瘤中增强Warburg效应从而促进肿瘤细胞增殖、在胶质瘤、肝癌、乳腺癌中增强肿瘤迁移以及侵袭能力。也有报道其作为剪接调控因子参与淋巴系统的免疫响应过程。PTBP1在肿瘤中引起的AS事件是复杂多样的,既往的研究手段无法彻底阐述某一肿瘤中全部的AS事件,高通量测序技术的出现为充分鉴定肿瘤中发生的AS事件成为可能。我们通过临床组织样本、细胞系及公共数据库分析发现PTBP1在骨肉瘤中表达升高并与患者不良预后显著相关,或许可以成为骨肉瘤治疗的新靶点。考虑到PTBP1在骨肉瘤中的高表达及其在多种肿瘤中的广泛作用,其作为一种原癌基因,在骨肉瘤恶性生物学行为中的重要角色值得进一步深入研究。目的1.明确PTBP1在骨肉瘤中的表达情况以及其与患者预后的相关性。2.明确PTBP1对骨肉瘤恶性生物学行为的影响。3.探索PTBP1促进骨肉瘤恶性生物学行为的可能机制。4.探索PTBP1通过调控可变剪接在骨肉瘤中发挥促癌作用的机制。5.探索PTBP1在泛癌水平影响肿瘤恶性生物学行为共性机制及其作为预后标志物、新治疗靶点的可能性。方法1.利用于海军军医大学第二附属医院骨肿瘤科手术的骨肉瘤患者肿瘤样本,通过免疫组化(IHC;Immunohistochemistry)和蛋白质免疫印迹(WB;Western Blot)实验检测PTBP1在骨肉瘤中的表达水平。使用WB检测PTBP1在多种人骨肉瘤细胞系(MG63、Sao S2、U2OS、HOS)及人间充质干细胞细胞系(h BMSC)中表达水平。2.通过TARGET数据库中OS数据集,探究PTBP1表达水平与骨肉瘤患者临床预后的相关性。通过收集的GEO公共数据库中人骨肉瘤数据集(GSE152048)和自测人松质骨单细胞转录组数据,在单细胞层面进一步揭示PTBP1在肿瘤与正常组织以及肿瘤内部具体细胞类型间的表达差异并初步探索可能机制。3.通过CRISPR/Cas9及过表达质粒构建PTBP1敲除及过表达细胞系,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR;Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)及WB实验验证PTBP1敲除及过表达效率。通过CCK-8细胞增殖、Transwell细胞迁移及侵袭实验明确PTBP1表达水平对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响。4.从多个数据库中收集包括肿瘤与正常组织的表达、拷贝数变异、肿瘤突变负荷等多组学数据。以肉瘤(SARC;Sarcoma)为重点,从PTBP1在泛癌水平的表达及其对肿瘤预后的影响、自身突变频率、其与肿瘤免疫浸润、基因不稳定性以及药物敏感性相关性等多方面,探索PTBP1对多种肿瘤恶性生物学行为的共性影响,以便进一步探索其在骨肉瘤中的作用机制。5.通过三代全长转录组测序技术,分析基因表达差异并结合基因调控网络(GRN;Gene Regulatory Network)分析寻找PTBP1影响肿瘤功能机制中的关键基因,鉴定PTBP1显著调控的AS事件并通过q RT-PCR验证AS前后靶基因表达水平差异。结合TARGET-OS数据集分析PTBP1在骨肉瘤中调控的潜在信号通路。6.通过RNA蛋白结合免疫沉淀技术(RIP;RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay)探索在骨肉瘤中PTBP1蛋白可能直接结合的靶基因以及其调控的主要功能,通过Motif分析探索其在骨肉瘤中新的结合基序。结果1.PTBP1在骨肉瘤中表达升高并与患者的不良预后显著相关。在单细胞层面,其在肿瘤内广泛表达,并可能与细胞周期调节、促进增殖以及免疫抑制相关。2.调节PTBP1表达可以显著影响骨肉瘤的增殖、迁移以及侵袭能力,过表达PTBP1后骨肉瘤恶性生物学行为显著增强,而敲除PTBP1后结果相反。3.PTBP1突变最常发生于肉瘤中,其在包括肉瘤的多种肿瘤中显著高表达并与患者不良预后、细胞周期、剪接体、TGFB和WNT等通路的调控显著相关。其在泛癌水平与免疫抑制、肿瘤基质成分减少、肿瘤突变、基因组不稳定及部分药物敏感性等密切相关。4.EGR1、TNF、TP73、DDIT3等关键基因在PTBP1促进骨肉瘤恶性生物学行为中承担关键作用。PTBP1通过激活细胞周期、可变剪接、代谢及抑制肿瘤免疫、NF-KB、JAK-STAT等相关通路促进骨肉瘤恶性生物学行为。5.PTBP1在骨肉瘤主要通过促进外显子跳跃(ES;Exon skipping)调控AS事件,并鉴定出574个基因可能与该蛋白直接结合,其中13个基因发生了显著的AS事件,8个基因发生了m RNA水平的改变。靶基因主要参与调控细胞分化、增殖、迁移、细胞周期和HIF-1等信号通路。新发现的motif为进一步探索其在骨肉瘤中的促癌机制提供了新视角。结论1.PTBP1在骨肉瘤中高表达并与患者的不良预后、肿瘤细胞增殖活性的维持相关。其高表达与肿瘤恶性生物学行为显著相关,降低PTBP1表达水平可以显著抑制肿瘤增殖、迁移以及侵袭能力。2.PTBP1在骨肉瘤中通过激活细胞周期、可变剪接、代谢以及抑制肿瘤免疫、NF-KB、JAK-STAT等相关通路促进骨肉瘤的恶性生物学行为。3.PTBP1在骨肉瘤中主要通过促进ES调控AS事件,通过其蛋白直接结合基因调控多个基因的AS事件及转录本的差异表达。新发现的motif为深入了解PTBP1的促癌机制提供方向,并有望成为精准调节促癌剪接事件的新靶点。4.PTBP1在泛癌水平具有评估预后价值,调控细胞周期、TGFB、WNT等相关通路,与抑制肿瘤免疫、肿瘤突变及部分药物敏感性等相关。5.在免疫肿瘤学背景下,PTBP1在骨肉瘤及多种肿瘤中发挥着关键性的致病作用,有望指导骨肉瘤患者预后并成为新的治疗靶标。
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