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X射线衍射晶体学是解析生物大分子结构的重要技术手段之一,广泛用于酶的三维结构解析。通过解析酶以及酶/小分子复合物的晶体结构,结合分子动力学的研究,可以获取酶与小分子的相互作用机制,并在分子水平上探究酶结构与功能的关系,为进一步对酶的理性改造提供结构依据。DehDIV-R是本实验室发现的R-2-卤代酸脱卤酶,产自假单胞菌ZJU6,能专一性地水解R-2-氯丙酸,具有重要的应用前景。目前关于R-2-卤代酸脱卤酶的晶体结构报道较少,对于其底物立体选择性研究也仅仅在R,S-2-卤代酸脱卤酶的结构基础上间接进行解释。本文通过多步层析法制备得到高纯度的DehDIV-R蛋白,采用悬滴气相扩撒法,在0.1 mol/HEPES(pH 7),12%PEG 6000,0.2 mol/l MgC12,8mmol/LCHAPS条件下获得高质量晶体,并在上海同步辐射光源收集到一套分辨率为2.35 A的数据,采用CCP4 online服务器分子置换法解析得到DehDIV-及的晶体结构。基于结构分析的结果显示,DehDIV-R是由多个α螺旋组成的假二聚体结构,且活性中心Asp205与Asn131形成氢键,有利于Asp205活化水分子。接着,基于DehDIV-R与R-2-氯丙酸以及与S-2-氯丙酸的分子对接结构,经限制性分子动力学模拟计算,推测活化的水分子的氧原子与R-或S-2-氯丙酸的Cα之间的距离以及角度上的差异导致了 DehDIV-R的底物立体选择性。PaL是本实验室发现的脂肪酶,来自产碱假单胞菌CGMCC4405,能拆分d,1-薄荷醇丙酸酯生成光学纯的1-薄荷醇,具有重要的应用前景。但将PaL用于拆分四对外消旋的薄荷醇丙酸酯时,非对映体选择性较低,因此需要探究其手性识别机制从而为下一步理性改造提供指导。前期解析得到PaL的晶体结构,但其催化三联体处于不合理位置——His302位于酶分子表面。本文尝试采用多种方式来获得催化三联体位置合理的PaL结构,最终通过粗粒化分子动力学模拟计算,发现His302多次进出活性口袋,并最终通过常规分子动力学模拟计算优化得到了结构合理的PaL。基于上述结构,通过分子对接与分子动力学模拟计算来探究PaL非对映体选择性较低的原因。结果表明脂肪酶催化过渡态时,四对外消旋薄荷醇丙酸酯C1处的手性影响了 His302质子化的氢原子与底物羟基氧原子之间氢键的形成,从而决定了其能否被水解。然而PaL仅能识别C1处的手性,而对于C2和C5处的手性无法识别,导致其非对映体选择性较差,因此无法专一性地水解1-薄荷醇丙酸酯。