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芝麻香型白酒作为我国传统白酒的创新酒种,以独特的浓、酱、清融合的生产工艺特点和优雅的芝麻香味而闻名。高温制曲为芝麻香型白酒酿造提供丰富的微生物种类、生物酶、各类香味物质及其前驱物质,其质量好坏直接关系到芝麻香型白酒的出酒率和酒质。由于受到传统发酵特点及其研究方法的限制,使得对高温制曲过程中微生物的群落结构研究和认识还很有限。本文以山东扳倒井芝麻香型白酒高温大曲为研究对象,首次将现代分子生物学和分子生态学技术应用于高温大曲细菌群落结构研究中,为探索芝麻香型白酒高温大曲功能性微生物的作用机制提供科学依据。本文利用非培养PCR-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)和16Sr DNAV5-V8区克隆文库构建技术,结合可培养细菌的分离筛选和多相鉴定技术,动态分析高温大曲曲房环境、母曲、大曲原料、大曲发酵前期、中期、中后期、后期和出房时的优势细菌群落结构,并对其中高温功能性细菌进行分离筛选和鉴定。研究结果发现高温大曲中细菌种类丰富,主要来源于曲房环境、母曲和大曲原料,随着发酵温度的升高形成以高温细菌为主的群落结构。曲房环境中第一优势细菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),丰度为21.67%,在高温大曲发酵前期、中期和后期也被检测到,且其丰度分别为13.7%、12.32%和23.15%。高温大曲原料中的第一优势细菌为泛菌属(Pantoea sp),丰度为73.68%,仅在大曲发酵前期少量被检测出,第二优势细菌为魏斯氏菌属(Weissella sp.),丰度为16.99%,第三优势细菌乳杆菌属(Lactobacillus sp.),丰度为4.57%,在大曲发酵的前期、中期和后期被分别被检测到,其丰度分别为前期3.22%和11.29%、中期6.89%和25.11%、后期3.74%和7.47%。大曲发酵前期的第一优势细菌是高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.),丰度为47.57%,发酵中期、后期和出房时也检测到该菌属,且丰度分别为4.93%,15.68%和4.35%。大曲发酵结束时的优势细菌是Rubellimicrobium sp.,丰度是31.52%。研究还从高温大曲中分离、筛选出85株高温细菌,并获得1株产中性蛋白酶菌株M5,中性蛋白酶活力96.06U/g,显著高于对照菌株,经16S rDNA序列分析和gryA基因序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. Subtilis.);分离筛选出的优势细菌ZM60经多相鉴定为普通高温放线菌(Thermoactinomycesvulgaris),该菌株55℃生长良好,37℃不生长,具白色气生菌丝,产孢子,具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶的活力。作为高温大曲的优势细菌,该菌株在芝麻香型白酒特殊性风味的形成过程中的作用尚未报道过。本研究除发现了过去曾研究报道过的高温大曲优势细菌芽孢杆菌属(Bacillussp.),魏斯氏菌属(Weissella sp.)和乳杆菌属(Lactobacillus sp.)外,还发现了尚未在高温大曲研究中报道过的细菌菌种,如泛菌属(Pantoea sp.),(?)嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.),高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.), Kroppenstedtia sp.,莱西氏菌属(Laceyella sp.),片球菌属(Pediococcus sp.)和志贺氏菌属(Shigellasp.)等,其中泛球菌属(Pantoea sp.)菌种来源于植物性原料中,高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.)和莱西氏菌属(Laceyella sp.)为属于芽孢菌科的高温放线菌, Kroppenstedtia sp为近年来新发表菌属,志贺氏菌属(Shigella sp.)为常见致病菌,这些细菌在高温大曲制曲过程中发挥的功能性作用和带来的影响还有待下进一步深入研究。