论文部分内容阅读
血管性认知功能障碍（Vascular cognitive impairment,VCI）是由全脑长时间缺血或缺氧所导致的认知功能障碍综合征,认知功能相关脑区的功能异常是导致VCI的关键因素。探讨电针百会、神庭穴对VCI大鼠脑功能影像学的影响,并进行关键脑区差异蛋白表达分析,及其功能验证性研究,所获结果预期为临床应用提供理论基础和实验依据。方法:本研究共分为两部分实验:实验一:对雄性SD大鼠采用双侧颈总动脉结扎手术（Bilateral common carotid artery occlusion,2VO）造成VCI模型后,随机分为模型组8只,电针组8只;另选8只SD大鼠仅分离双侧颈总动脉不结扎,作为假手术组。2VO术后14天,电针组大鼠进行电针百会、神庭穴干预,电针参数:疏密波,1/20Hz,每天1次,每次30分钟,干预4周;假手术组大鼠和模型组大鼠进行同等条件下抓取,不予其他干预。干预前采用Morris水迷宫,干预后采用Barnes迷宫进行认知能力评估。干预后对3组大鼠进行功能磁共振（functional magnetic resonance imaging,f MRI）扫描,观察脑区功能活动的变化,并取3组大鼠海马组织进行差异蛋白表达分析。实验二:将雄性SD大鼠分为5组,假手术组,模型组,电针组,电针+抑制剂组和电针+生理盐水组,每组16只,其中进行学习记忆能力测试8只,另外8只进行工作记忆能力测试;假手术组,模型组,电针组干预方法同实验一,电针+抑制剂组在2VO术后第14天进行GST抑制剂尾静脉注射（90mg/kg）,电针+生理盐水组同期注射等量生理盐水,随后对电针+抑制剂组及电针+生理盐水组进行电针干预,方法同电针组。采用Morris水迷宫和Barnes迷宫进行学习记忆能力检测,工作记忆水迷宫和Y迷宫进行工作记忆能力检测。干预后对5组大鼠进行f MRI扫描;采用丙二醛（Malondialdehyde,MDA）检测和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）检测5组大鼠前额叶、海马两个脑区氧化应激程度;免疫组化检测前额叶、海马两个脑区的8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-Hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G）表达;q RT-PCR检测5组大鼠前额叶、海马两个脑区GSTM5,MGST3,ACOT11,CDK17,PIK3的m RNA含量;Western Blot蛋白质免疫印迹法检测前额叶、海马两个脑区GSTM5、MGST3蛋白表达。实验一结果:1.电针对VCI大鼠认知行为学的影响:干预前Morris水迷宫定向航行实验第一天模型组大鼠潜伏期高于假手术组大鼠（P<0.05）第二、三、四天:模型组大鼠、电针组大鼠相比于假手术组大鼠逃避潜伏期均增加（P<0.05）,且模型组及电针组组间比较无差异（P>0.05）,水迷宫空间探索试验中,模型组大鼠、电针组大鼠相比于假手术组大鼠穿越平台次数减少（P<0.01）,目标象限时间持续时间百分比减少（P<0.05）;干预后Barnes迷宫实验模型组大鼠潜伏期均高于假手术组大鼠（P<0.001）;电针组大鼠相比于模型组大鼠逃避潜伏期下降（P<0.05）,Barnes迷宫空间探索试验中,模型组大鼠相比于假手术组大鼠接触目标洞口次数减少（P<0.001）,目标象限时间持续时间百分比减少（P<0.001）;电针组大鼠相比于模型组大鼠接触目标洞口次数增加（P=0.024）,目标象限时间持续时间百分比增加（P=0.032）;2.电针对VCI大鼠脑功能活动的影响:干预后利用BOLD-f MRI序列对3组大鼠脑部进行功能磁共振扫描,Re Ho结果显示:模型组相比于假手术组前额叶、海马脑区的局部一致性明显减弱（P<0.005）,同时双侧纹状体、感觉皮层及梨状皮层也出现局部一致性降低（P<0.005）;电针组相比于模型组前额叶、海马及梨状皮层脑区的局部一致性明显增强（P<0.005）;功能连接分析结果显示:模型组相比于假手术组前额叶、海马等脑区的功能连接活动减弱（P<0.005）,电针组相比于模型组前额叶、海马等脑区的功能连接活动增强（P<0.005）;3.电针对VCI大鼠海马蛋白组学的影响:与假手术相比,模型组海马差异表达≥1.2倍的蛋白共有41种,其中27种上升,14种下降。与模型组相比,电针组海马差异表达≥1.2倍的蛋白共有29种,其中20种上升,9种下降;进一步富集分析显示,与假手术组相比,模型组海马差异表达蛋白主要富集于麻疹通路;与模型组相比,电针组海马差异表达蛋白主要富集于流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、药物代谢-细胞色素P450通路、谷胱甘肽代谢通路等。实验二结果:1.电针调控GST对VCI大鼠认知行为学的影响:（1）学习记忆功能检测:干预后Barnes迷宫实验中电针+抑制剂组大鼠相比于电针+生理盐水组大鼠逃避潜伏期上升（P<0.05）;Barnes迷宫空间探索试验中,电针+抑制剂组大鼠相比于电针+生理盐水组大鼠接触目标洞口次数减少（P=0.035）,目标象限时间持续时间百分比减少（P=0.01）;（2）工作记忆功能检测:干预后工作记忆水迷宫实验中相比于电针+盐水组大鼠,电针+抑制剂组大鼠在第一、三、四组象限内逃避潜伏期上升（P<0.05）;干预后Y迷宫实验中,电针+抑制剂组大鼠相比于电针+盐水组大鼠Y迷宫交替率下降（P=0.013）;2.电针调控GST对VCI大鼠脑区局部一致性活动的影响:模型组相比于假手术组前额叶、海马脑区的局部一致性明显减弱（P<0.001）,同时双侧感觉皮层及梨状皮层也出现局部一致性降低（P<0.001）;电针组相比于模型组前额叶、海马及梨状皮层脑区的局部一致性明显增强（P<0.001）;电针+抑制剂组相比于电针组在海马,前额叶及梨状皮层脑区出现局部一致性降低（P<0.001）;电针+生理盐水组相比于电针组除梨状皮层外无明显的局部一致性改变。3.电针调控GST对VCI大鼠海马、前额叶氧化应激的影响:相比于假手术组大鼠,模型组大鼠前额叶及海马两个脑区MDA含量均上升（P<0.001）;相比于模型组大鼠,电针组大鼠前额叶及海马两个脑区MDA含量均下降（P<0.001）;相比于电针+盐水组大鼠,电针+抑制剂组大鼠前额叶及海马两个脑区MDA含量均上升（P<0.001）;相比于假手术组大鼠,模型组大鼠前额叶及海马两个脑区SOD活力均下降（P<0.001）;相比于模型组大鼠,电针组大鼠前额叶及海马两个脑区SOD活力均上升（P<0.001）;相比于电针+盐水组大鼠,电针+抑制剂组大鼠前额叶及海马两个脑区SOD活力均下降（P<0.01）;免疫组化结果显示:相比于假手术组大鼠,模型组大鼠前额叶及海马两个脑区8-OHd G含量均上升（P<0.001）;相比于模型组大鼠,电针组大鼠前额叶及海马两个脑区8-OHd G含量均下降（P<0.01）;相比于电针+盐水组大鼠,电针+抑制剂组大鼠前额叶及海马两个脑区8-OHd G含量均上升（P<0.05）。4.电针调控GST对VCI大鼠氧化应激相关蛋白表达的影响:相比于电针+盐水组大鼠,电针+抑制剂组大鼠前额叶脑区MGST3m RNA及CDK17m RNA含量均下降（P=0.029,P=0.043）,PIK3m RNA含量上升（P=0.029）;其海马脑区GSTM5m RNA含量下降（P=0.013）,PIK3m RNA含量上升（P=0.044）;免疫印迹结果显示:相比于电针+盐水组大鼠,电针+抑制剂组大鼠前额叶及海马两个脑区GSTM5及MGST3含量均下降（P<0.05）。结论:电针百会、神庭穴通过调控谷胱甘肽转移酶的表达改善海马、前额叶氧化应激损伤,改善海马、前额叶局部一致性活动及其功能连接强度,从而减轻VCI认知功能障碍。