第一部分胆管癌中microRNA差异的筛选和验证[目的]在胆管癌肿瘤组织及其癌旁胆管组织中筛选microRNAs的差异表达,为下一步的研究选择研究对象。[方法]采用高通量MicroArray表达谱芯片检测20对胆管癌及癌旁胆管组织中miRNA的表达差异;通过实时定量PCR在胆管癌组织和胆管癌细胞系中,对部分miRNA的表达差异进行验证。[结果]同癌旁胆管组织相比较,胆管癌组织中一共有10条miRNA存在表达差异,其中6条上调,4条下调;miR-16在胆管癌组织和胆管癌细胞系中均表达降低,与芯片检测的结果相符合。[结论]胆管癌组织和癌旁胆管组织中miRNAs的表达存在明显差异。在胆管癌组织和胆管癌细胞系中miR-16的表达均降低,可以作为进一步的研究对象。第二部分miR-16对胆管癌细胞系增殖及迁移能力的影响[背景与目的]MicroRNA是一类非编码短链小RNA,它在多数恶性肿瘤（包括CCA）的生长中扮演重要角色。在本研究中,我们对miR-16在CCA中的表达量进行检测,并探讨其对胆管癌细胞增殖、迁移能力的影响。[方法]通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time polymerase chain reation,Real-Time PCR）检测45对CCA及其癌旁组织中miR-16的表达水平,进一步检测4种人类胆管癌细胞系和人类正常胆管上皮细胞系HIBEC的miR-16表达量。运用MicroRNA模拟物（Mimic）和抑制剂（Inhibitor）进行细胞内转染,在体外实验中检测miR-16对CCA细胞增殖、迁移能力的影响,用流式细胞术测定miR-16在CCA细胞凋亡中的影响。[结果]我们发现,相对于癌旁组织,miR-16在人类CCA组织中表达显著下调。体外实验证实过表达miR-16后可以抑制CCA细胞的增殖、迁移和促进细胞凋亡,反之,干扰miR-16可以促进CCA细胞的增殖、迁移和抑制细胞凋亡。[结论]本研究结果表明miR-16对CCA有抑制作用,并影响了 CCA细胞增殖、迁移及促进细胞凋亡的能力,可能对CCA患者的治疗及预后有一定的价值。第三部分miR-16潜在作用靶点的筛选和验证[背景与目的]筛选并验证miR-16的可能作用靶点,深入探究miR-16在胆管癌肿瘤的发生发展中的作用和机制。[方法]通过Target Scan、PicTar和miRanda软件预测可能的靶基因,并通过预实验和文献证明初步筛选出目的靶基因;在RNA和蛋白水平验证两者正负相关性;通过双荧光素酶报告提供靶基因与miR-16直接作用的更多证据,并明确其结合位点;检测通过转染手段过表达和抑制miR-16的胆管癌细胞株中Yap1的R NA和蛋白水平;通过rescue实验,同时过表达miR-16和Yap1亦或同时抑制两者,检测对胆管癌细胞系及体外造模的增殖和迁移作用的影响,进一步验证mi R-16介导Yap1在胆管癌中的生物相关性。[结果]Yap1是miR-16潜在靶基因;miR-16可以通过结合于Yap1的3’UTR两个可能的结合位点调控Yap1的表达;并可能通过miR-16介导,从而影响胆管癌细胞的增殖和迁移;[结论]miR-16通过直接作用于Yap1影响胆管癌细胞的增殖和迁移能力。第四部分miR-16功能的体内验证及其临床意义[目的]体内验证miR-16对胆管癌增殖和转移的抑制作用;在胆管癌临床样本中分析miR-16与临床病理特点之间的关系,评估miR-16对于胆管癌患者的预后判断的价值。[方法]裸鼠皮下移植瘤和胆管癌肺转移模型分析miR-16对胆管癌增殖和转移能力的影响;收集2008年4月至2011年6月期间于南京医科大学第一附属医院肝脏外科行手术切除的45例胆管癌患者的病理资料,分析miR-16与临床病理参数之间的关系,选取70例有完整随访数据的胆管癌患者,分析miR-16表达量对于胆管癌患者预后的预测价值。[结果]miR-16可以抑制裸鼠胆管癌移植瘤的生长和转移;miR-16的表达与肿瘤的大小、淋巴结转移以及TNM分期存在相关性,随访数据证实,miR-16低表达组的患者,无论是无瘤生存率还是总体生存率,均明显低于miR-16高表达组的患者。[结论]在体内miR-16可以通过靶定Yap1调节其表达从而抑制胆管癌的生长和转移;miR-16与肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分期负相关,miR-16的低表达与胆管癌患者的不良预后有关。因此miR-16有可能成为胆管癌诊断和治疗的新靶点,并能预测胆管癌患者的预后。