念珠菌是人体的条件致病真菌,可在皮肤上寄生或引起口腔炎、食道炎、阴道炎等疾病。在免疫力低下的人群中还可引起严重的播散性念珠菌病,常常危及生命。随着放化疗、移植以及艾滋病病人的增加,念珠菌病已经成为威胁这些病人生命的主要杀手,是主要的致死性并发症之一。近年来,深部真菌感染的人数剧增,其中80%以上是念珠菌感染。2010年,美国一项有关院内感染的调查发现[1]念珠菌感染居第四位,而且病死率极高。在所有念珠菌中,白念珠菌毒力最强、临床上最常见。因此,白念珠菌已成为真菌研究的重点。临床上白念珠菌的致病率和致死率逐年攀升,除了与一些长期抗生素的滥用引起的肠道菌群紊乱有关,同时白念珠菌的生物被膜因其强大的致病性和耐药性也逐渐引起人们关注。生物被膜常常存在于移植物的表面与感染相伴随而具有重要的临床意义。有文献指出[2]一些设备如静脉导管、起搏器、人工关节等在美国的应用已经非常普遍,每年有超过100万患者是该类人群。这些设备提供一些潜在的健康效益但是同时相关的感染率提高到30%。基于白念珠菌生物膜重大的临床意义,对白念珠菌生物膜形成机制的研究有利于我们对白念珠菌的致病性和耐药性进行深入的了解。体外的研究表明[3]白念珠菌生物膜形成一般分为四个阶段。(1)首先是白念珠菌酵母态细胞的粘附和定植,(2)酵母细胞的增长和扩增以小菌落的形式偶联于基底层,(3)假菌丝和菌丝的生长与细胞外基质产生共存,(4)白念珠菌的酵母态细胞从生物膜扩散至其它新的位置,我们利用10%小牛血清+spider培养基[3],37℃,200rpm为培养条件在体外诱导白念珠菌生物膜生成,筛选实验室菌株库里存在的300个利用基因重组的方法敲除的白念珠菌基因缺失株,进而筛选出影响白念珠菌生物膜形成的基因,从而寻找出新的对白念珠菌生物膜形成有意义的基因。我们利用体外观察生物膜形成的方法筛选出4个白念珠菌基因缺失株,他们的菌株编号分别是M6(ORF19.287),M36(ORF19.1625),M58(ORF19.2570),M136(ORF19.6607),我们通过XTT法和Biomass的方法进一步验证了其生物膜的形成缺陷。然后我们利用白念珠菌基因库数据查找这四个基因的功能,结果我们发现这四个白念珠菌突变株所缺失的基因具有相似的功能,都具有NADPH的功能且与线粒体呼吸链相关。因为它们没有明确的基因名称,所以我们将筛选出的菌株称为线粒体呼吸链相关基因(Mitochondrial respiratory chain related gene,MRCRG)缺失株。真菌可以通过糖酵解和有氧呼吸两种途径利用碳源获得能量用于合成代谢,而由电子呼吸链传递所提供的能量是真菌生长所需的主要能量来源。当线粒体呼吸链-2-相关基因缺乏时,白念珠菌的有氧呼吸受到限制,这时糖酵解成为主要的供能途径。白念珠菌生长所需的碳源分为发酵碳源和非发酵碳源,发酵碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖等,发酵碳源包括甘油、氨基酸、甘露醇等。mrcrg缺失会影响到白念珠菌对碳源的利用,因此线粒体呼吸链相关基因缺失株在发酵碳源和非发酵碳源两中不同功能物质培养条件下,所表现出来的白念珠菌生长,菌丝形成和生物膜形成的差异是我们此次研究的重点。首先,我们利用发酵碳源(葡萄糖)和非发酵碳源(甘露醇)为培养条件,通过测量生长曲线和spotassay两种方法比较白念珠菌标准菌株sn250和△mrcrg之间的生长差异;同时比较不同碳源培养条件下△mrcrg的生长差异。其次,我们分别用这两种碳源供能,在37℃,200rpm的培养条件下(诱导菌丝形成的培养条件)[4]比较△mrcrg菌丝形成的差异。最后我们利用不同碳源作为培养基体外诱导白念珠菌生物膜形成,比较△mrcrg在不同碳源培养条件下生物形成的差异。典型的白念珠菌生物膜结构表现为在基底层有数层酵母细胞粘附于移植物表面,其在酵母细胞的上方有丰富的细胞外基质覆盖,其间有大量菌丝生长,生物膜的厚度可达50-350μm[5]。介导白念珠菌生物膜形成的关键除了产生丰富的细胞外基质外,白念珠菌由酵母向菌丝的形态学转变也是其不可或缺的一部分,同时,白念珠菌形态学的转变是其具有侵袭性和致病性的关键。因此为了进一步验证mrcrg的缺失在不同碳源培养条件下影响白念珠菌菌丝的形成[6],我们利用文献[7]提供的诱导菌丝形成的经典液培养基ypd和spider,为了进一步验证△mrcrg对不同碳源的利用情况,我们以两种经典的诱导菌丝形成的培养基为基础配置成4种不同碳源的培养基。它们分别是(i)ypd(yep+2%葡萄糖),(ii)yep+2%甘露醇,(iii)spider,(iv)未加甘露醇的spider+2%葡萄糖。在37℃,200rpm培养条件下,结果发现mrcrg缺失株m6在ii和iii培养基中始终以酵母态的形式存在,而在i和iv培养条件下白念珠菌的菌丝生长正常,同时对照组sn250在这4种培养基中菌丝生长均正常。利用测量生长曲线和spotassay两种方法评价mrcrg的缺失对白念珠菌在不同碳源培养条件下白念珠菌生长的影响,结果显示在i培养基中△mrcrg与sn250相比生长轻度受限,而在iii培养基中与sn250相比△mrcrg生长明显受限。我们利用i、ii、iii、iv作为体外培养白念珠菌生物膜的培养基,结果发现sn250在这四种培养基上均能形成完整的生物膜,而△mrcrg仅在i和iv培养基上能形成完整的生物膜,而在ii和iii上几乎无生物膜形成。根据以上结果我们发现在mrcrg的缺失影响白念珠菌对甘露醇(非发酵碳源)的利用供能,进而影响其生长、菌丝形成及生物膜形成。我们发现mrcrg的缺失影响白念珠菌对甘露醇的利用进而影响其菌丝的生长。我们通过RT-q PCR的方法证实M6在Spider液体培养基中,37℃培养条件下,菌丝相关基因ALS3,ECE1,HWP1,HYR1的表达量降低。进一步从基因水平验证了MRCRG的缺失影响白念珠菌对甘露醇(非发酵碳源)的利用,进而影响其菌丝的形成本研究从表观形态学和基因水平两个方面验证了线粒体呼吸链相关基因的缺失在葡萄糖(发酵碳源)和甘露醇(非发酵碳源)两种不同碳源培养条件下,对白念珠菌生长,菌丝形成和生物膜形成方面的差异。