重组人鼻病毒(humanrhinovirusHRV)3C蛋白酶因其稳定性好、酶切特异性强、活性高等特点,被广泛应用于蛋白的纯化研究和生产中。3C蛋白酶是人鼻病毒中的非结构蛋白的关键酶,其基因编码区全长552bp,相对分子质量约20 kDa,可特异识别位于Gln-Gly之间的肽键,识别位点是 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-↓-Gly-Pro。本论文主要目的是获得高纯度、高酶活以及高表达的无标签HRV3C蛋白酶,通过HRV3C蛋白酶表达载体构建、3C蛋白酶表达与纯化工艺的研究,并经中试规模放大试验确认,取得以下结果。(1)选用大肠杆菌原核表达体系,通过基因克隆、种子筛选等方法,成功构建了无标签的HRV 3C蛋白酶工程菌并建立种子库,经SDS-PAGE电泳检测,其蛋白表达量高,且绝大部分是可溶的,目的蛋白占可溶总蛋白的21%,易于纯化。(2)确定了 HRV 3C蛋白酶工程菌的摇瓶培养条件:诱导温度30℃、诱导时间16 h、诱导剂(乳糖)浓度2 g·L-1 每克菌体表达量不低于6 mg。(3)优化了 HRV3C蛋白酶的纯化工艺:菌体破碎后,离心上清经羟基磷灰石(CHT)层析(洗脱条件为pH8.0、20 mM PB、200 mMNaCl)、60%硫酸铵饱和度盐析、Superdex 75凝胶层析方法,可得到符合要求的3C蛋白酶。(4)经连续中试放大试验,证明该发酵、纯化工艺方法稳定、可靠,3C蛋白酶SDS-PAGE电泳纯度高达100%、酶的比活力不低于2500U/mg,每克菌体经纯化后3C蛋白酶产量不低于2.4 mg。本论文的研究为实现生产HRV3C蛋白酶的产业化奠定了扎实的基础。