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大蒜含有丰富的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD),超氧化物歧化酶具有清除超氧自由基(O2-·)功能,有效地预防O2-·对机体的毒害作用。本研究采用热变性、聚乙二醇6000(PEG)沉淀作用、DEAE-纤维素柱层析三种方法对大蒜细胞溶质中的超氧化物歧化酶进行了分离纯化;利用改良的连苯三酚自氧化法测定了酶活力,同时研究了酶对温度、pH的稳定性;并对酶的类型、在紫外光区的吸收光谱等性质进行了研究。研究结果如下: 1.大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶粗酶液中存在一种干扰酶活性发挥的物质,该物质对热不稳定,而大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶对热较稳定,利用超氧化物歧化酶、干扰物质、杂蛋白的热稳定差异,用热变性法进行初步分离。实验表明在60℃20min进行热变性,钝化了抑制酶活性发挥的干扰物质,并使酶液中总蛋白浓度从24mg/mL下降到15.8mg/mL,得到比活为15.9U/mg的粗酶。 2.聚乙二醇6000(PEG)是一种水溶性非离子聚合物,可使蛋白质发生沉淀作用,并且其对被沉淀的蛋白质有较好的选择性;当溶液中PEG的浓度为16%~26%,上清液中超氧化物歧化酶活力保持不变;当PEG浓度提高至28%时,上清液中酶活力开始下降,至PEG浓度为40%时,上清液中酶活力为零,表明酶液中超氧化物歧化酶从溶液中完全析出,得到了比活为129.3U/mg的酶蛋白。 3.PEG沉淀后的酶蛋白经DEAE-纤维素(DE-52)柱层析,利用pH7.8 0.05mol/L磷酸缓冲液(PB)+1.0mol/L NaCl梯度洗脱,使超氧化物歧化酶蛋白和杂蛋白有效地分开。层析最佳的条件是:流速为1.2mL/min、柱高比为1:10、进样量为6mL;超氧化物歧化酶被完全被洗脱的时间为33min,洗脱体积为40mL,杂蛋白被洗脱下来洗脱时间为66min,体积为80mL,表明DEAE-纤维素(DE-52)柱层析具有较高的柱效和分辨率,得到了比活为3145.5U/mg超氧化物歧化酶蛋白。 4.大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶是一种对热和酸碱度稳定性较好的酶,低于60℃酶活力较为稳定,60℃30min酶活力仅损失19.1%;高于70℃酶活力损失明显,70℃30min酶活力损失56.6%,80℃30min酶活力损失70.8%;pH4~9范围内酶活力保持稳定,pH<4和pH>9时,超氧化物歧化酶活力下降明显,pH2.0时剩余酶活力为21%,pH10时,剩余酶活力49.1%,pH=12时,酶活力完全损失。 5.大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶对H2O2和氰化物敏感,经鉴定酶的类型是Cu·Zn-SOD;在紫外光区的最大吸收峰是258nm,表明其是含有酪氨酸和色氨酸较少的一类酶蛋白。 6.经过三步分离纯化,从500g大蒜中得到15.6mg产品,比活为3145.5U/mg,纯化倍数为197.8,回收率39.2%。