磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）具有提高认知力、抗抑郁、缓解紧张压抑、辅助激活酶和改善老年痴呆症等功能,在食品、化妆品和制药行业的应用受到广泛的关注。虽然PS在自然界中来源广泛,但是由于在植物中含量较低和动物脑细胞来源的不安全性,限制了PS的工业化应用。因此,利用磷脂酶D（Phospholipase D,EC3.1.4.4,简称PLD）催化磷脂酰转移制备PS是目前最安全高效的方法。PLD广泛地存在于植物、动物和微生物中,但是从自然界中分离纯化PLD,生产成本过高,酶活较低,不能满足PS工业生产的需求。因此,本论文尝试在链霉菌和大肠杆菌中表达PLD,以期望实现PLD的高水平表达和廉价制备,并对PLD进行固定化研究,为酶催化法制备PS的工业化生产奠定基础。论文研究分三个部分:1.PLD在链霉菌中表达。采用组成型Perm E*启动子,通过对p SET152和p CJW93进行改造,构建了含有组成型启动子的整合型p SET254质粒和含有组成型启动子的游离型p CJW254质粒。同时也构建了含有诱导型启动子Pti PA的游离型p CJW93质粒。将来源于Streptoverticillium cinnamoneum和Streptomyces chromofuscus的PLD基因（sv PLD和sc PLD）分别克隆到上述三种质粒中,通过种属间的接合转移,将构建好的六种重组质粒转导入变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK2、Streptomyces lividans K4-1141和Streptomyces albus宿主中进行重组表达,最高酶活只能达到0.085±0.0034 U/m L。2.PLD在大肠杆菌中表达。分别将来源于Streptoverticillium cinnamoneum和Streptomyces chromofuscus的PLD（sv PLD和sc PLD）基因克隆并在大肠杆菌中表达。首先,研究了p ET载体、培养基种类、诱导条件对PLD表达的影响。最佳组合是使用不含his标签的p ET28a所构建的p ET28a+sc PLD/BL21（DE3）重组菌株,并在25℃下使用2.5 g/L乳糖在TB培养基中诱导表达。其次,对TB培养基的组成成分进行详细优化,优化后的合成培养基成分为0.7%（w/v）山梨醇、0.3%（w/v）淀粉、1.0%（w/v）鱼蛋白胨、4.0%（w/v）安琪酵母、17 mmol/L KH2PO4和72 mmol/L K2HPO4。在摇瓶中诱导32 h后,OD600达到13.15±0.23,sc PLD酶活最高达到104.28±2.67 U/m L,时空产率为3.26±0.083 U m L-1 h-1,比活为5.11±0.13 U/mg。最后,在5.0 L发酵罐进行放大培养,通过流加乳糖并在20℃诱导,sc PLD酶活和OD600最高分别达到122.94±1.49 U/m L和28.17±1.53。为了进一步降低成本,用1.0%（w/v）糊精代替混合碳源（0.7%（w/v）山梨醇和0.3%（w/v）淀粉）仍然可以获得105.81±2.72 U/m L的sc PLD酶活。系统优化后,PLD的高水平可溶性表达在大肠杆菌中得以实现。在摇瓶和发酵罐水平达到的PLD酶活是迄今为止文献中报道的最高值。3.PLD的固定化研究。以磁性Fe3O4作为载体,通过吸附-聚集-交联的方法,用Fe3O4固定化sc PLD,制备成磁性交联酶聚集体,酶活回收率达到72.89%,固定化酶活为437.34±6.60 U/g。与游离酶相比,磁性交联酶聚集体在不同温度和p H的耐受性方面得到提升,但由于与底物的亲和力降低,需要更高浓度的磷脂酰胆碱（PC）和Ca2+作为反应底物。另外,还研究了固定化酶的有机溶剂耐受性,为PS合成中双相体系构建选择有机溶剂提供了参考。磁性交联酶聚集体在连续催化13次后,酶活仍保留在76%以上,其半衰期为331.67 min,说明所选择的固定化方案可以提高酶的稳定性,从而提高其在催化反应过程中的重复使用性能。