研究背景生物钟是生物为了适应环境变化,调整机体生理机能和新陈代谢以约24小时为周期规律运转的内生机制。通常认为哺乳动物的生物钟系统遵循着主生物钟-外周生物钟层级调控的模式。光通过引导下丘脑视交叉上核中的主生物钟,以神经体液等方式同步并协调外周各器官系统的生物钟,调控生物的生理、代谢和行为。在分子机制层面,Per2、Bmal1、Nr1d1、Dbp等一系列核心生物钟基因及其蛋白组成了一套高度保守的转录-翻译反馈回路,存在于体内的几乎每一个细胞中。同时,越来越多的研究提示,磷酸化、糖基化等翻译后修饰是实现生物钟系统稳定运行和精准调控的重要条件。例如,人PER2第662位丝氨酸的磷酸化修饰调节着生物钟周期的长短。一个涉及各个层次的复杂的生物钟调控网络正逐渐进入到人们的视野。光照和食物是哺乳动物中最重要的两个环境授时因子,它们共同协调着主生物钟与外周生物钟系统。与光照周期不协调的进食节律可诱导外周器官生物钟系统与主生物钟解耦。在过去的二十年里,大量的研究集中在肝脏对进食节律的适应上,而鲜有脂肪、肾脏、心脏等其他外周器官适应进食节律的研究。不仅如此,研究的内容也大多局限于转录-翻译层次,对于翻译后修饰,尤其是磷酸化修饰,在外周生物钟系统适应进食节律的过程中起到了怎样的作用还尚未有人系统研究。现代生活背景下,生物钟紊乱日益常见,尤其是夜间进食等不规律进食方式,是最近发现的血脂异常与肝脂代谢紊乱的新型风险因子。而控制进食时间窗的限时进食（time-restricted feeding,TRF）可改善代谢综合征患者的血压血脂。因此,深入探讨外周生物钟系统适应进食节律的机制,将为防治生物钟紊乱相关的代谢疾病提供新的策略与靶点。目的初步探讨外周生物钟系统适应进食节律的特点及其可能机制。方法1、建立TRF小鼠模型,仅在夜间进食（Nighttime-restricted feeding,NRF）模拟小鼠正常进食节律,仅在白天进食（Daytime-restricted feeding,DRF）模拟反向进食信号。一周后连续时间点收集肝脏、内脏脂肪、肾脏和心脏样本进行转录组学分析,并针对肝脏进行磷酸化组学分析。2、制备p-PER2（S971）抗体,Dot blot和Western blot检测抗体特异性。3、利用慢病毒构建PER2WT、PER2S971A和PER2S971D细胞株,Western blot和荧光显微镜检测构建是否成功。4、利用Seahorse细胞能量代谢分析仪测定PER2WT、PER2S971A和PER2S971D细胞株在不同底物下的代谢特征。5、利用蛋白半衰期实验、蛋白亚细胞定位实验和实时定量荧光PCR测定PER2WT、PER2S971A和PER2S971D细胞株中PER2蛋白的稳定性、亚细胞定位以及不同突变体对生物钟基因和代谢基因的影响。结果1、转录组学显示:DRF反转肝脏生物钟基因表达节律,引导内脏脂肪生物钟基因表达节律减弱甚至消失,但肾脏和心脏生物钟对DRF的引导存在抵抗。2、肝脏磷酸化组学显示:肝脏生物钟蛋白的磷酸化水平响应进食节律,PER2 S971位点的磷酸化修饰可能受到进食节律的特异性调控。3、p-PER2（S971）抗体制备成功,显示出较好的特异性。3、Seahorse细胞能量代谢分析显示:无论以葡萄糖为底物还是以脂肪酸为底物,相较于其他两组,模拟S971磷酸化的PER2S971D细胞株中线粒体有氧呼吸增强而糖酵解被抑制。4、蛋白半衰期实验、蛋白亚细胞定位实验显示:S971位点点突变不显著影响PER2蛋白的半衰期和亚细胞定位。5、实时定量荧光PCR显示:相较于其他两组,PER2S971D细胞株中Bmal1表达增加,Cpt1a相较PER2WT有轻微上调。结论1、外周生物钟系统对进食节律的适应存在组织特异性。2、PER2 S971位点的磷酸化修饰可能参与进食节律对肝脏生物钟与能量代谢的调节作用。