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1.研究背景和目的：手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)是以手、足皮肤疱疹和口腔溃疡为主要临床特征,病原为多种肠道病毒(Enterovirus,EV)的一种传染病。临床上以发热和手、足、臀、口腔等部位出现皮疹、溃疡等表现为主,个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎和脑干脑炎等致命性的多系统并发症。手足口病以婴幼儿发病为主,传播途径多样,托幼机构或儿童聚集的单位易出现暴发。手足口病已成为世界性的疾病,近年来在亚太地区尤其活跃,马来西亚、新加坡、台湾、日本等地均发生大规模爆发和流行。最新的监测表明手足口病发病率呈现上升的趋势,新加坡2001年发病率为1.225/10万,而2007上升至4359/10万。我国卫生部法定传染病的统计报告：2008年手足口病共报告488955例,死亡126例,2009年报告1155525例,死亡353例,发病及死亡人数均位于丙类传染病的首位,2009年的发病率及死亡率环比分别增加135.13%和180.00%,发病率上升的流行趋势明显。肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)是引起手足口病的主要病原,以神经毒性及高变异性为特点,人肠道病毒一般在人群中引起较轻的临床症状,EV71却具有和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus, PV)相似的特点,常引起神经系统病变及其合并症。关于EV71的毒力机制尚未明确,尤其没有足够的致病机理来解释为什么在部分感染者中能引起重症脑炎及弛缓性麻痹。尽管基因分型分析不能确认某种亚型引起了神经毒性,个别氨基酸的变异或者是衣壳蛋白的空间结构的改变是否导致毒力改变尚无定论,目前很难通过某一种因素来解释一种普通肠道病毒能在特定地区引起严重中枢神经系统病变和死亡。广州气候环境湿热,属于手足口病高发地区,本研究立足于广州市手足口病的定点收治医院,通过对收治状况的研究,描述流行特征,分析流行病毒型别和进化规律,并对肠道病毒71型的病原学和致病机制进行初步探讨。总体目标是阐明广州市近两年来手足口病的流行特点和流行规律,初步掌握引起手足口病的流行优势病原型别的变迁规律,探索EV71可能的致病机制,为开展今后的防控工作提供科学依据。2.研究方法：2.1以广州市某手足口病定点收治医院为监测点,收集临床诊断为手足口病住院患儿的疱疹液、粪便及咽拭子标本,同时收集手足口病患儿的临床及流行病学资料；2.2用细胞培养、RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction)等方法对临床标本进行病毒分离、病毒核酸的扩增和鉴定,并运用降落聚合酶链反应(Touchdown PCR, TD-PCR)优化扩增效率；2.3对鉴定为EV71阳性的标本进行VP1基因节段的双向扩增,扩增产物经克隆后进行核苷酸序列测定和分析,与GenBank中的EV71参考毒株进行比较,运用MEGA 4软件,采样邻接法(Neighbor-joining),最大似然模式(Maximum Composite Likelihood)构建系统进化树；2.4采用Real-timeRT-PCR对一例手足口病死亡患儿的全身各组织病毒检测,并对病毒分离培养和基因序列分析；2.5采用HE染色和CD68+抗体免疫组织化学法染色相结合,对一例人感染EV71的尸体解剖组织标本进行系统病理学观察；2.6应用免疫组织化学法,用EV71病毒VP1蛋白单克隆抗体免疫组化标记脑组织不同部位,研究手足口病死亡病例脑组织EV71病毒抗原的分布。2.7用EV71 888/GZ/CHN/2008临床分离株攻击Balb/c小鼠乳鼠,观察小鼠发病过程和临床表现,Real-time RT-PCR检测病毒在不同部位的分布情况,观察组织病理改变,通过免疫组织化学方法研究病毒抗原在中枢神经系统的分布。3.结果3.1 2008-2009年某定点医院收治情况：2008年广州市某定点医院4-12月份共收治手足口病住院患儿309例,2009年1-12月共收治手足口病住院患儿154例,发病时间分布主要集中在每年的4-7月份,主要发病年龄集中在1-4岁。男性发病率高于女性,男女的性别比为2.13：1。2008年共15例患儿出现并发症,2009年2例为重症,未出现手足口病死亡病例。3.2临床标本病毒检出结果：本次研究中共检测2008年度手足口病患儿标本207份,EV71阳性率为64.7%(134/207),CoxA16阳性率14.5%(30/207)。检测2009年度手足口病患儿标本122份,EV71阳性率为32.8%(40/122),CoxA16阳性率45.1%(55/122)。两年间病毒检出率具有统计学差异(χ2=42.68,P<0.001)。从检测的结果可以初步判断,2008年广州市手足口病以EV71感染为主,同时也存在CoxA16及其它肠道病毒感染。2009年广州市手足口病EV71感染比例较2008年减少,同时CoxA16及其它肠道病毒感染的比例增加。而不同类型的标本中,以粪便标本的检出率为最高85.9%(122/142),其次为疱疹液71.4%(10/14),咽拭子的检出率为最低62.7%(32/51),(χ2=12.8,P=0.002)。3.3临床分离的EV71基因进化分析：2008年-2009年广州市13株EV71临床分离株与C4基因型的EV71聚成一簇,全部属于C4a基因亚型,并和国内2007-2008从广东、山东、安徽和北京等地分离出的EV71的核苷酸序列具有有较高的同源性(93.7%-99.9%)。3.4 EV71感染死亡病例病毒分布及组织病变特点：死亡病例全身组织器官均能检测出病毒核酸,心脏、肝,结肠等多处器官组织有炎症表现,淋巴系统组织细胞明显反应性增生,但从全身病理组织的改变可以看出引起致命损伤的为重度肺水肿伴肺出血。HE染色结合脑组织CD3+、CD20+、CD68+抗原染色结果支持大脑存在组织炎症改变,而小脑和脑干炎症改变不明显。3.5 EV71病毒在死亡病例脑组织的分布：EV71病毒VP1蛋白单克隆抗体免疫组化标记法检测死亡病例脑组织病毒的分布,发现EV71主要分布在大脑胶质细胞,小脑颗粒细胞及脑干神经元细胞,提示人脑组织的多种神经细胞为病毒作用靶点。3.6 EV71小鼠乳鼠攻毒实验：对从死亡病例分离的EV71 888/GZ/CHN/2008株,通过腹腔感染途径攻击Balb/c小鼠乳鼠,成功诱导乳鼠发病发病。乳鼠出现活动减少,萎靡,后肢麻痹等一系列症状,体重明显减轻。病毒在全身器官组织广泛分布,病理学研究发现,EV71病毒导致大脑及脊髓等神经系统的多种神经元细胞发生变性,并且在出现下肢麻痹的同时已存在肺组织水肿、肺出血等组织病变。4.结论4.1手足口病在广州地区具有季节性,患儿以男性为多,CoxA16和EV71是2008-2009年广州地区手足口病流行的主要致病病毒,但两年间两种病毒的构成的比例有变化,2009年CoxA16占的比例有所增加。4.2本研究分离获得的2008-2009年的EV71病毒株构建种系进化树,均聚集在C4a基因型分支上,与中国内地当前流行的基因型一致。4.3 EV71感染死亡病例全身心脏、肝,结肠等多处器官组织有炎症改变,淋巴系统组织内细胞明显反应性增生,致命损伤的为重度肺水肿伴肺出血。人大脑胶质细胞,小脑颗粒细胞及脑干神经元细胞等多种神经细胞为病毒主要攻击对象。4.4 EV71临床分离株可以成功导致Balb/c乳鼠出现典型迟缓性麻痹症状,脑组织各部分及脊髓等神经组织病毒广泛分布,神经元变性,发病早期已存在肺组织病变。本研究为建立小鼠EV71感染模型奠定了基础。