论文部分内容阅读
本文以脱毒型食源性致病菌Escherichia coli O157:H7为研究对象,研究了高压二氧化碳(high pressure carbon dioxide, HP CD)诱导E. coli进入亚致死状态以及亚致死细胞复苏现象,并探讨了HPCD诱导E. coli进入亚致死状态及亚致死细胞复苏的可能机制。主要研究内容如下：(1)确定HPCD诱导E. coli形成亚致死细胞的条件。研究了5MPa,25、37、45℃处理条件下HPCD对生理盐水体系(physiological saline, PS)和磷酸盐缓冲液体系(phosphate buffered saline, PBS)中的E. coli亚致死状态的诱导情况,结果表明HPCD不能大量诱导PS体系中的E.coli进入亚致死状态,但能诱导PBS体系中的细胞大量进入亚致死状态。对5MPa/25℃/30min、5MPa/37℃/15min、5MPa/45℃/10min三个条件处理后的PBS体系做流式分析和电镜分析,发现亚致死细胞表现为PI阴性,由PI阳性得到的钝化率与由非选择性培养基得到的钝化率无显著性差异,流式分析不依赖培养基种类,对HPCD杀菌效果的表述更客观。利用扫描电镜和透射电镜对HPCD处理后的细菌进行外部形态和内部结构的观察,表明HPCD引起了细胞结构的显著性变化,而通过复苏培养,细胞的形态完成了一定的修复。(2)分析亚致死细胞对酸、温度和乳酸链球菌素(nisin)的敏感性。与未处理细胞相比,亚致死细胞对4℃的敏感性无显著差异,而对45℃的温热、7种酸和nisin的敏感性显著性增强。对]HPCD+nisin对PBS和胡萝卜汁体系中的E. coli杀灭效果进行研究,发现HPCD+nisin比单独HPCD达到完全杀灭效果所需的时间短,表明HPCD与nisin结合使用对PBS和胡萝卜汁体系中的E. coli细胞有增强杀灭效果。杀菌曲线呈现出延滞期和快速杀菌期两段式,修正Gompertz模型可以对杀菌曲线进行较好拟合。(3)分析亚致死细胞复苏过程。HPCD处理产生的亚致死细胞在胰蛋白胨大豆肉汤(TSB, pH7.0)、蛋白胨水(pH7.0)和胡萝卜汁(pH6.8)中孵育能完成复苏,而在PBS和pH低于4的TSB中则不能复苏。亚致死细胞在不同培养基中复苏的速度为：TSB>胡萝卜汁>0.1%蛋白胨水>PBS,表明HPCD诱导产生的大部分亚致死细胞复苏时需要较为丰富的营养成分。通过向复苏培养基中添加代谢抑制物(叠氮化钠、氯霉素、利福平、青霉素、浅蓝菌素),发现在HPCD诱导产生的亚致死细胞复苏过程中,能量合成、蛋白合成和RNA合成都是必要的。此外,钙和镁离子也参与复苏过程。(4)提出HPCD诱导E. coli形成亚致死细胞及亚致死细胞复苏的可能机制。通过对E. coli正常对数期细胞、HPCD诱导产生的亚致死细胞、HPCD处理致死细胞、经复苏培养的亚致死细胞进行蛋白组学分析,在死细胞-活细胞、亚致死细胞-活细胞、亚致死细胞-死细胞、复苏细胞-亚致死细胞和复苏细胞-活细胞五组对比中,共得到差异表达蛋白766个。对死细胞-活细胞、亚致死细胞-活细胞、亚致死细胞-死细胞的差异蛋白进行功能分析,发现与活细胞相比,死细胞和亚致死细胞中参与生理代谢、DNA损伤修复方面和细胞防御途径的蛋白整体下调,而在细胞壁代谢、分泌系统和逆境应答损伤方面整体上调；亚致死细胞在保护物质的积累合成、代谢和核区的主动关闭上与死细胞相比有明显差异,这种差异可能是导致亚致死细胞形成的原因。对复苏细胞-亚致死细胞的差异蛋白进行功能分析,发现复苏细胞中代谢整体上调,复苏过程可能不仅是细胞结构损伤的修复,也是细胞生化代谢网络和正常生理行为的激活与重建。