1.背景复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指连续3次或以上于20周前发生的自然流产,约发生于1%-3%的生育年龄妇女[1]。RSA的病因复杂,包括：①遗传因素,如染色体平衡易位、缺失、倒位、嵌合等；②血栓前状态,如抗磷脂抗体综合征、高同型半胱氨酸血症等；③自身免疫紊乱,如抗心磷脂抗体、抗β2糖蛋白1抗体、抗核抗体、抗精子抗体、抗子宫内膜抗体等自身抗体的形成；④子宫异常,如子宫先天畸形、宫腔粘连、宫颈机能不全等；⑤内分泌异常,如黄体功能不全、高泌乳素血症、多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常等；⑥感染因素。上述机制仅能解释一半的RSA病例。至少仍有约50%的RSA病例找不到明确病因,称为原因不明复发流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA),与母体对于胎儿的同种免疫反应有关。胚胎继承来源于父系的多态基因,作为半抗原可激活母体免疫应答,从而排斥胚胎。然而正常情况下这种免疫排斥并不会发生,这提示在正常妊娠中母体对于胎儿的同种免疫反应受到了调节。近年来随着生殖免疫学的迅猛发展,学者们开始认为妊娠其实是一种胚胎-母体耐受共生的状态。这种耐受状态形成复杂,系各种免疫因素通过有机协调达到母胎间的免疫平衡。如果这种免疫平衡状态出现紊乱,胚胎会遭受免疫攻击而发生流产。研究发现,原因不明复发流产患者体内存在人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)相容性异常、自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)细胞数量及功能异常、T细胞亚群失衡等免疫平衡紊乱。近年来复发性流产中T细胞亚群的失衡越来越受到关注。T细胞根据其功能主要可分为辅助性T细胞(T helper cell, Th)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,CTL)、调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)o Treg细胞是T细胞一个非常重要的亚群,持续表达CD4. CD25,约占外周血CD4阳性T细胞的5%～10%[5]。叉头框螺旋转录因子(Foxp3)是Treg细胞的一个特异性蛋白标志,CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可通过胞间直接接触抑制免疫应答,研究发现CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞同时低度表达CD127,即CD4+CD25+CD127lowTreg细胞,因此可以综合使用CD4、CD25、CD127进行标记来检测具有抑制性功能的Treg细胞。另外,Foxp3阴性的CD4+CD25+Treg细胞还可通过产生白细胞介素-10(interlukin-10, IL-10)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)等细胞因子发挥作用。IL-10可抑制巨噬细胞,抑制IL-2、干扰素-Y(interferon-γ,IFN-γ)等促炎Thl型细胞因子的分泌；TGF-β1是强有力的免疫抑制因子,可抑制T细胞的自分泌、抑制巨噬细胞和NK细胞杀伤活性；而IL-10和TGF-β1又可反过来诱导外周血CD4+CD25+Treg细胞的发生。Treg细胞在抑制主动免疫和对同种异体器官移植物耐受中起重要作用,可能也在维持母胎耐受中起关键作用。研究发现在正常妊娠中CD4+CD25+Treg细胞数量增加,而在原因不明复发流产患者的外周血及蜕膜中Treg细胞所占比例显著降低。近年来发现一种选择性产生IL-17的Th细胞新亚群,这类细胞被称为Th17,在介导炎症反应、自身免疫疾病发病机理及免疫排斥中起重要作用。Th17参与宿主抗细菌、真菌、病毒,并可能与风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化及炎症性肠病的发病相关[14,15]。Th17细胞可能在排斥胚胎抗原中起重要作用。有报道显示在复发性流产患者外周血及蜕膜中的Th17细胞与Treg细胞在数量上呈负相关。现普遍认为在原因不明复发流产患者体内存在Treg/Th17免疫平衡模式的紊乱[16]。目前对于URSA最常用的免疫治疗为淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyteimmunization therapy, LIT)。淋巴细胞主动免疫治疗主要是采用丈夫或第三方供血者的淋巴细胞作为免疫原,通过对复发性流产患者进行皮内注射淋巴细胞,刺激机体产生免疫应答,即同种致敏治疗。LIT可有效地抑制妊娠期母体对胚胎的免疫排斥反应,然而其具体的作用机制仍未完全明确。为了更高效地使用LIT对原因不明复发流产患者的免疫平衡紊乱进行纠正,有必要对LIT与Treg/Th17免疫平衡紊乱的关系进行深入研究。本研究通过比较原因不明复发流产病人接受淋巴细胞主动免疫治疗前、后,外周血中Treg细胞和Th17细胞在数量和功能两方面的变化,探讨原因不明复发流产Treg/Th17免疫平衡与淋巴细胞主动免疫治疗之间的关系,进一步了解复发性流产的发病机制,为治疗提供新的切入点,并对进一步评估免疫治疗疗效和预测流产发生具有重要的临床意义。2.目的本研究通过探讨淋巴细胞主动免疫治疗对原因不明复发流产病人的Treg/Th17免疫平衡的影响,进一步了解原因不明复发流产的发病机制及淋巴细胞主动免疫治疗的作用机制,以期丰富妊娠免疫理论,为原因不明复发流产的治疗及疗效评估提供理论基础。3.方法研究资料：选取2014年6月至2015年1月在南方医科大学附属深圳市妇幼保健院复发流产中心就诊的妇女,从中筛选出25例原因不明复发流产病例入实验组。入组需同时符合以下标准：(1)有连续3次或3次以上自然流产史；(2)年龄小于40岁；(3)夫妻双方无染色体异常；(4)妇检、阴道分泌物检查、生殖道支原体检查、生殖道衣原体检查、TORCH IgM检查、B型超声检查和(或)宫腔镜检查排除器质性病变、生殖器官解剖畸形及感染因素；(5)性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌相关检查正常；(6)D-二聚体、纤维蛋白原降解产物等血栓前状态相关检查阴性：(7)抗心磷脂抗体IgM (ACA IgM)、抗心磷脂抗体IgG (ACA IgG)、抗β2糖蛋白1抗体、抗核抗体(ANA)、抗精子抗体(ASAb)、抗子宫内膜抗体(EmAb)、抗卵巢抗体(AOAb)等自身抗体阴性；(8)男方精液常规正常；(9)封闭抗体阴性；(10)既往未进行过任何主动免疫治疗。研究方法：(1)使用CD4、CD25、CD127荧光抗体对Treg细胞进行标记,使用CD8、CD3、IL-17A荧光抗体对Th17细胞进行标记,利用流式细胞仪分别检测实验组淋巴细胞主动免疫治疗前、后外周血Treg细胞与Th17细胞所占的比例。(2)应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别检测实验组淋巴细胞主动免疫治疗前、后血清IL-10、TGF-β1和IL-17浓度。(3)利用t检验对实验组淋巴细胞主动免疫治疗前、后的外周血Treg细胞所占比例、Th17细胞所占比例、Treg/Th17细胞比例及血清IL-10、TGF-β1和IL-17浓度进行统计学分析,以判断淋巴细胞主动免疫治疗是否能引起URSA患者的Treg细胞、Th17细胞数量及功能上的改变,并对URSA患者体内的Treg/Th17免疫平衡造成影响。进一步探讨原因不明复发流产的免疫学发病机制,淋巴细胞主动免疫治疗与原因不明复发流产的关系。4.结果(1)流式细胞学检测外周血Treg细胞、Th17细胞结果分析①不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例为(2.8±0.5)%；治疗后外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例为(4.4±0.8)%,P<0.01,差异有统计学意义。②不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前外周血CD4+CD25+CD127low Treg细胞所占比例为(1.9±0.5)%；治疗后外周血CD4+CD25+CD127low Treg细胞所占比例为(3.4±0.7)%,P<0.01,差异有统计学意义。③不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前外周血CD8-CD3+IL-17A+Th17细胞所占比例为(3.3±0.5)%；治疗后外周血CD8-CD3+IL-17A+Th17细胞所占比例为(1.8±0.5)%,P<0.01,差异有统计学意义。④不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前外周血Treg/Th17比例为0.86±0.17；治疗后外周血Treg/Th17比例为2.63±0.63,P<0.01,差异有统计学意义。⑤淋巴细胞主动免疫治疗后原因不明复发流产患者外周血CD4+CD25+Treg细胞与CD8-CD3+IL-17A_Th17细胞所占比例的变化具有负相关(r=-0.704,P<0.001)。⑥淋巴细胞主动免疫治疗后原因不明复发流产患者外周血CD4+CD25+ CD127lowTreg细胞所占比例的改变与外周血Th17细胞所占比例的改变具有负相关(r=-0.623,P<0.001)。(2)酶联免疫吸附法检测血清IL-10、TGF-β1、IL-17水平结果分析①不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前血清IL-10水平为(7.11 ±2.11)pg.ml;治疗后血清IL-10水平为(9.46±2.19)pg/ml,P<0.01,差异有统计学意义。②不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前血清TGF-β1水平为(2582.49±732.32)pg/ml；治疗后血清TGF-β1水平为(3584.88±665.63)pg/ml,P<0.01,差异有统计学意义。③不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗前血清IL-17水平为(3.72±1.11)pg/mI；治疗后血清IL-17水平为(2.29±0.79)pg/mI,P<0.01,差异有统计学意义。(3)流式细胞学检测结果与酶联免疫吸附法检测结果的相关性分析①淋巴细胞主动免疫治疗后原因不明复发流产患者外周血Th17细胞所占比例的改变与血清IL-17水平的改变具有正相关(r=0.687,P<0.001)②淋巴细胞主动免疫治疗后原因不明复发流产患者外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例的改变与血清TGF-β1水平的改变具有正相关(r=0.564,P=0.003)。③淋巴细胞主动免疫治疗后原因不明复发流产患者外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例的改变与血清IL-10水平的改变具有正相关(r=0.604,P=0.001)。5.结论(1)淋巴细胞主动免疫治疗可使不明原因复发流产患者的外周血CD4+ CD25+Treg细胞和CD4+CD25+CD127IowTreg细胞所占比例显著增加,CD8CD3+ IL-17A+Th17细胞所占比例显著减少,这可能是其作用机制之一。(2)淋巴细胞主动免疫治疗可使不明原因复发流产患者血清TGF-β1、IL-10水平显著增加,且二者均与治疗后CD4+CD25+Treg细胞所占比例增加的水平呈正相关,这可能是LIT治疗通过提高Treg细胞的数量并影响其功能,增加其分泌TGF-β1、I1L-10等免疫抑制因子。(3)淋巴细胞主动免疫治疗可使不明原因复发流产患者血清IL-17水平对比治疗前显著降低,且与降低的Th17细胞水平相关,这提示LIT治疗可能通过降低Th17细胞的数量并抑制其分泌IL-17的功能起作用。(4)不明原因复发流产病人淋巴细胞主动免疫治疗后外周血CD4+CD25+ Treg细胞／CD8"CD3+IL-17A+Th17细胞比相对治疗前显著升高,且二者呈负相关,而治疗后的外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞所占比例的改变也与CD8CD3+IL-17A+Thl7细胞所占比例的改变呈负相关。这提示URSA患者体内存在Treg/Th17免疫平衡紊乱,LIT治疗对URSA患者的Treg/Th17平衡影响可能是其治疗URSA的机制。