小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一种高度接触性传染的病毒性疾病,主要感染小反刍动物,对畜牧业带来严重的经济危害,是世界动物卫生组织(ore)规定必须上报的疫病。目前主要依靠弱毒疫苗进行预防,但该类疫苗难以利用血清学方法区分疫苗免疫和野毒感染动物,不利于该病的控制和消灭,而且弱毒疫苗还存在着毒力返强的安全隐患。因此,研发安全、有效的新型疫苗尤为重要。病毒样颗粒由于在结构上与天然病毒相似,并且不含核酸,从而具有很好的免疫原性和安全性,作为新型亚单位疫苗在人类和动物疫苗领域得到广泛研究。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统构建了表达PPRV H或F蛋白的病毒样颗粒,并在小鼠和山羊上进行了免疫原性的初步研究。由于杆状病毒-昆虫细胞表达系统可以对表达的外源蛋白进行转录后加工和多种修饰,表达的蛋白质具有与天然蛋白质相似的生物学活性,基于以上优点,该系统特别适合有囊膜病毒VLP的制备。本实验构建了同时表达小反刍兽疫病毒的M、N、H和F蛋白的重组杆状病毒和单独表达四个结构蛋白的重组杆状病毒,将重组杆状病毒感染昆虫细胞,在无病毒系统中重构病毒的出芽过程,检测培养基中的病毒样颗粒来确定病毒粒子出芽的必需结构蛋白。试验结果表明小反刍兽疫病毒M蛋白在没有其他结构蛋白的参与下就可以促进病毒粒子从感染细胞内释放,是构成病毒粒子出芽的主要驱动力。当M蛋白与N、H和F蛋白共同表达时,所形成的病毒样颗粒形态和大小与真实病毒粒子更加相似,当多种结构蛋白同时表达时,VLP出芽效率提高。通过对PPRV VLP制备的研究,初步探索了PPRV的组装和出芽机制,M蛋白是形成VLP的必要条件,其他结构蛋白的参与可提高VLP的出芽效率和形成与天然病毒更相似的结构。病毒样颗粒由于具有和天然病毒相似的结构,可通过和天然病毒感染相同的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,目前已制备了多种人类和动物病毒的VLP颗粒,用于疫苗免疫研究。为了评价构建的PPRV VLP的免疫效果,本研究选择前期构建的三种重组杆状病毒rBac-MH、rBac-MF和rBac-MHF用于PPRV VLP的制备和进行动物免疫。用间接ELISA方法检测血清特异性抗体的消长,用竞争ELISA进行VLP免疫和PPRV弱毒免疫的鉴别检验,用病毒微量中和试验进行中和抗体检测,用ELISPOT试验评价免疫小鼠脾淋巴细胞体外刺激后细胞因子IFN-γ的变化情况,用淋巴细胞增殖实验评价小鼠和山羊的细胞免疫水平。结果表明不需添加任何佐剂,经皮下免疫小鼠和山羊后,PPRV VLP (PPRV-H、PPRV-F和PPRV-HF)可刺激机体产生病毒特异性的IgG应答、中和抗体和淋巴细胞增殖。其中,PPRV-H和PPRV-HF诱导的免疫应答水平与弱毒疫苗免疫组相当,而PPRV-F免疫组体液免疫应答水平略低于其他免疫组,但细胞免疫应答效果好。以上研究结果表明,制备的PPRV VLP疫苗有确实的刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答的能力,有望成为DIVA型PPR候选疫苗。