S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）是一种重要的生物活性物质,具有保护肝脏、抗抑郁和舒缓关节疼痛等功效,在功能食品和药品领域具有巨大的应用价值。然而,目前报道的生产工艺多以昂贵的甲硫氨酸为底物,成本高且转化率低,造成SAM价格昂贵。本研究在不添加甲硫氨酸的条件下,以解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HZ-12为出发菌株,通过代谢工程手段强化SAM合成途径,并创造性地将工程化的SAM合成途径与三羧酸（TCA）循环进行耦合,进一步缺失突变分支与降解途径,显著提高了SAM的产量,具体结果如下:首先,对B.amyloliquefaciens的SAM合成代谢途径进行了系统的代谢工程研究。在原始菌HZ-12中游离表达了不同物种来源的SAM合成酶基因、高丝氨酸O-琥珀酰转移酶基因、胱硫醚-γ-合酶基因和高丝氨酸脱氢酶基因,缺失突变了菌株自身的胱硫醚-β-合酶基因和甲硫氨酸合成酶基因的抗-抗终止子片段,考察了这些基因对SAM合成的影响。结果显示,强化表达来源于酿酒酵母的SAM合成酶基因SAM2、大肠杆菌的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶基因met A和胱硫醚-γ-合酶基因met B,缺失突变胱硫醚-β-合酶基因mcc A,可显著提高SAM的产量。综合上述有益的基因操作,在原始菌HZ-12中叠加整合表达酿酒酵母SAM2、大肠杆菌met A和met B基因,并敲除mcc A基因,获得工程菌株HSAM1,其最大SAM产量达67.41 mg/L,比原始菌HZ-12（27.91 mg/L）提高了142%;同时,工程菌HSAM1中天然SAM合成途径基因的转录量显著提高,关键底物天冬氨酸、同型丝氨酸和甲硫氨酸消耗加快,进一步证实SAM合成途径得到了强化。分析B.amyloliquefaciens代谢途径发现,琥珀酰辅酶A是SAM合成途径和三羧酸循环（TCA）的共同底物,TCA循环与SAM合成途径竞争琥珀酰辅酶A;若阻断TCA循环,强迫更多的琥珀酰辅酶A流经SAM合成途径,由SAM途径产生的琥珀酸回补TCA循环,将TCA循环和SAM途径耦合起来,有望协同增强SAM的合成。因此,在HSAM1菌株中缺失突变了琥珀酰辅酶A合成酶基因suc C,将工程化的SAM途径与TCA循环偶联,获得工程菌HSAM2的最大SAM产量为107.47 mg/L,比HSAM1增加了59%。缺失suc C后,SAM合成途径基因的转录量显著提高,天冬氨酸底物消耗加快,SAM前体物甲硫氨酸积累增加,证实途径耦合强化了SAM合成途径;同时,TCA循环中琥珀酸和富马酸浓度未产生显著变化,细胞生长未降低,表明SAM途径产生的琥珀酸补偿了TCA循环和细胞生长。进一步对SAM分支与降解途径进行了改造。缺失dap A、thr B和arg G基因后,SAM的产量分别比原始菌HZ-12提高了27%、35%和27%。在HSAM2中敲除thr B基因后,获得工程菌株HSAM4,其SAM产量达到143.93 mg/L,比HSAM2提高了42%。在HSAM4中游离表达最高效的基因SAM2,所得工程菌HSAM5的SAM产量达到226.92 mg/L,比HSAM4提高了53%。为了进一步提高SAM产量,调整了工程菌HSAM5的关键发酵参数,在24 h和48 h各补加1.5 m L十倍浓缩的发酵培养基,SAM的最大发酵产量达664.43 mg/L,远高于先前报道的在无甲硫氨酸培养基中的产量。