原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，以往的实验研究多数针对肿瘤细胞本身，但瘤细胞具有遗传不稳定性、高突变率和高异型性等特点，因此、未能取得满意的疗效。肝癌具有双重血液供应系统，是体内最富有血管的肿瘤之一，抗血管生成治疗将为原发性肝癌的治疗提供一个新的途径。 血管抑素(Angiostatin)是近年来发现的最有效的血管生成抑制因子之一，它特异性地作用于血管内皮细胞，通过抑制血管生成实现抑制肿瘤的生长和转移，是肿瘤基因治疗中非常有用的目的基因。但是，血管抑素抑制肿瘤血管生长的机制还不清楚。本研究通过构建重组人血管抑素，利用体外和在体实验方法观察了重组人血管抑素在肝癌细胞系中的稳定表达、对肿瘤的抑制作用、并着重探讨了血管抑素促进血管内皮细胞凋亡作用的机制，为将来开展血管抑素对肝癌的转基因治疗提供理论和实验依据。实验共分三个部分： 第一部分 重组人血管抑素(hANG)表达载体的构建及在肝癌细胞系中的稳定表达 为在体外和体内研究血管抑素对血管生成抑制作用的机制，我们首先构建了重组人血管抑素的表达载体并检测了其在肝癌细第四军医大学博士学位论文胞系中的稳定表达。在本部分的实验中，我们利用高保真的尸厂沁Turbo DNA聚合酶从人胚胎肝组织中扩增出血管抑素的kringlel一4基因片段，长度为1 100 bp，将其克隆到peR一BluntH一TOPO载体，利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段进行了验证，结果表明所获得的hANG序列与报道的序列完全一致。进一步采用双酶切位点KPnl、Xh口I将hANG基因片段克隆入真核表达载体PcDNA3.1(+)，经酶切鉴定进行筛选，获得了阳性克隆，表明含血管抑素基因的真核表达载体构建成功。为了验证重组人血管抑素基因能否在真核细胞中有效表达，我们利用脂质体转染技术将重组PcDNA3 .1一hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC一7721，利用逆转录PCR进行鉴定，结果表明质粒DNA己稳定地整合进SMMC一7721细胞基因组中。进一步利用Western一blot检测其表达产物，结果有分子量为38 kD的条带出现，表明在真核细胞SSMC一7721中成功地表达了血管抑素。同时，从生长曲线结果看来，转染PcDNA3.1一hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC一7721和未转染的SSMC一7721细胞的生长速度无明显差别，表明重组人血管抑素对人肝癌细胞SMMC一7721本身的生长无抑制作用，但转染重组hANG表达载体的肝癌细胞可以分泌血管抑素蛋白。因此、通过上述实验，我们成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC一7721肝癌细胞，为开展下一步的实验奠定了基础。第二部分hANG对裸鼠皮下和肝脏移植肿瘤的抑制作用 为了验证构建好的重组人血管抑素是否能有效发挥抑制肿瘤生长的作用，我们设计了以下在体实验。我们将稳定表达重组人血管抑素cDNA的人肝癌细胞SMMC一7721‘作为实验治疗组、sMMe一7721/peDNA3.l(+)作为空载体组、亲本的SMMC一7721细胞作为空白对照组。分别将三组肿瘤细胞种植于三组裸鼠皮下第四军医大学博士学位论文和另外三组裸鼠肝脏内，观察不同组肿瘤细胞致瘤力的变化。结果发现血管抑素组的裸鼠皮下肿瘤出现时间晚，且肿瘤体积显著小于其它两组(尸均<0.01)，肿瘤抑制率达69.2%，肿瘤重量仅为空白对照组的32.4%;在肝脏原位移植肿瘤方面，空载体组和空白对照组的裸鼠肝脏肿瘤灶的数量和体积明显多于血管抑素组。也就是说我们获得的重组人血管抑素可以显著抑制裸鼠皮下移植肿瘤和肝脏原位移植肿瘤的生长。为了明确重组人血管抑素对肿瘤生长的抑制作用与血管生长的关系，我们进一步利用CD34免疫组化染色，检测了瘤体内微血管密度的变化。结果表明血管抑素组肿瘤微血管密度显著少于空白对照组和空载体组(P均<0.01)，仅为空白对照组的57.4%，说明血管抑素抑制了移植肿瘤中新生血管的生长。本部分实验结果表明构建的重组人血管抑素能够有效的发挥抑制肿瘤血管生长的作用，进而对肿瘤的生长产生抑制。第三部分血管抑素抑制肿瘤血管生成的作用机制 虽然血管抑素通过抗血管生成作用来抑制肿瘤生长的作用是肯定的，但其作用机制却并不清楚。有研究提示血管抑素可能通过多种方式发挥其抑制血管生长的作用，如:抑制内皮细胞增生;促进内皮细胞凋亡;抑制内皮细胞定向迁移;抑制毛细血管芽生等。但上述作用的确切机制是什么，目前还不清楚。本部分实验试图从血管抑素与血管生长刺激因子，如VEGF和bFGF等的相互作用关系入手，探讨可能参与血管抑素促进内皮细胞凋亡作用的信号转导通路，为阐明血管抑素抑制血管生成的机制提供实验依据。在这部分实验中，我们将未进行转染的以及转染peDNA3.l(+)和peDNA3.l一hANG的sMMC一7721细胞进行培养后，收集培养上清作为条件培养基，分别命名为CM一N，CM一Mock和CM一ANG。提取蛋白质，用W七stern blot方法检测VEGF和bFGF的表达。结果观察到，VEGF和 bFGF在转染peDNA3 .1一hANG表达载体的SMMC一7221细胞的培养上清中的表达量，与其在转染空