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第一部分臭氧化油体外杀精实验目的:通过观察不同浓度臭氧化油对人精子活力的影响,探索其瞬时制动所有接触精子的最低有效浓度。方法:按照第五版人类精液检验与实验室处理手册,收集正常精液参数的人精液标本,采用密度梯度离心法对精液标本进行优化。用不同浓度臭氧化油(3、4、5、6、7μg/m L)100μL按1:1(v/v)与处理优化后的精子悬液共同孵育20s,记录20s后精子活力(PR+NP)%;(PR+NP)%为0组立即洗涤去除臭氧化油后重悬于精子培养液中进行精子活力恢复实验,分别在0、5、10、30、60min时间点观察去除臭氧化油后精子活力恢复情况。结果:臭氧化油与精子作用20s后,3、4、5、6、7μg/m L臭氧化油处理后精子活力分别为(30.11±4.15)%、(20.11±5.18)%、(7.50±2.96)%、(1.70±1.70)%、0,各实验组精子活力与橄榄油对照组[(72.70±2.42)%]与Ham’s F-10对照组[(77.90±2.10)%]比较均有显著性降低(P<0.01),橄榄油组与Ham’s F-10对照组比较无统计学差异(P>0.05);6μg/m L浓度臭氧化油组仅可见极少数精子原地活动,臭氧化油制动精子的MEC为(5.80±0.25)μg/m L;作用20s后精子活力为0组经洗涤去除臭氧化油后不同时间点观察至60min活力仍然未见恢复。结论:本实验剂量范围内臭氧化油呈剂量依赖性抑制体外精子活力,其瞬时(20s)制动所有接触的精子且经洗涤观察60min后活力仍不恢复的MEC为6μg/m L,提示6μg/m L浓度臭氧化油可能是最为理想的体外杀精子浓度。因此设定6μg/m L作为本文第二部分研究的有效剂量。第二部分臭氧化油的体外杀精作用机制探讨目的:观察臭氧化油(6μg/m L)对人精子活率、超微结构、功能及DNA完整性的影响,对其体外杀精作用机制进行初步探究。方法:收集正常精液参数的精液标本,采用密度梯度离心法优化精液标本,精子悬液分别与Ham’s F-10、橄榄油和臭氧化油(6μg/m L)按1:1(v/v)处理20s后离心洗涤收集精子沉淀。(1)伊红-苯胺黑染色法检测精子活率;(2)醋酸铀、柠檬酸铅双染法染色,在透射电镜下观察精子超微结构的改变;(3)通过精子线粒体膜电位检测评估线粒体功能;(4)用PSA-FITC和Hoechst 33258双重荧光染色法检测钙离子载体A23187诱发的活精子的顶体反应;(5)通过精子染色质结构分析来评估精子DNA的完整性。结果:(1)活率结果:臭氧化油组精子活率为(31.09±3.30)%,与橄榄油[(87.64±1.01)%]和Ham’s F-10[(89.73±0.84)%]组相比都有显著降低(P<0.01);(2)超微结构观察:Ham’s F-10对照组精子膜连续,顶体完整,线粒体排列有序,臭氧化油组精子膜破损不连续,明显肿胀,线粒体肿胀、排列紊乱,两组的轴丝9+2结构都未见明显破坏;(3)线粒体膜电位改变:臭氧化油、橄榄油和Ham’s F-10组正常线粒体膜电位所占的比例分别为(35.63±7.64)%、(77.5±2.90)%和(86.17±1.25)%,臭氧化油组与Ham’s F-10组和橄榄油组相比,都有显著性降低(P<0.01);(4)顶体反应结果:臭氧化油、橄榄油和Ham’s F-10组钙离子诱导的活精子顶体反应率分别为(19.01±2.92)%、(41.01±5.24)%和(43.83±4.75)%,臭氧化油组与Ham’s F-10和橄榄油组比较,都有统计学学差异(P<0.01);自发性顶体反应率分别是(12.56±1.10)%、(12.84±1.43)%和(11.73±1.92)%,三组未见明显差异(P>0.05);(5)DNA完整性结果:臭氧化油、橄榄油和Ham’s F-10组精子DNA碎片指数分别为(14.70±2.61)%、(11.01±2.07)%和(7.52±0.77)%,臭氧化油组与Ham’s F-10组相比差异有显著性(P<0.01)。结论:臭氧化油主要通过影响精子膜结构、功能及DNA的完整性等多个方面发挥其杀精避孕的功效。