鮸鱼三种先天免疫基因克隆及分子进化研究

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鱼类是较为低等和较为原始的脊椎动物类群,体内既存在着先天免疫,又存在着后天免疫,但与哺乳类相比,鱼类的后天免疫并不发达。而且鱼类生存的水生生境中充满着种类和数目众多的致病微生物,鱼类免疫系统受到的生存选择压力十分强大。因此,由于水生环境带来的强烈的生存压力和后天免疫欠发达的进化状况,使得鱼类的先天免疫在保护机体抵抗病原微生物入侵的过程中,可能发挥着更为重要的作用。本文以3种先天免疫基因为代表,对鱼类和哺乳类的先天免疫基因的进化历史和进化模式进行了分析,对鮸鱼(Miithchys miiuy)在正常情况下和应激条件下的表达模式进行了研究。首先通过筛选鮸鱼脾脏cDNA文库和分子克隆技术获得了鮸鱼3种先天免疫基因,包括补体基因C3和C9,以及Toll样受体2基因(Toll-like receptor2,TLR2)的序列,其次对基因序列进行了生物信息学和分子进化分析,最后对基因在健康以及应激条件下的表达模式进行了研究。对补体C3进行了进化枝模型和位点模型的分子进化分析。其中,进化枝模型,在所有脊椎动物、哺乳类动物、骨鳔鱼类和原棘鳍鱼类,以及棘鳍鱼类的祖先进化枝中,分别检测到了12、5、4、和6个正选择作用位点,表明C3基因在进化历史中,由于自然选择的影响,至少经历了四次正选择作用,分别发生在这4个祖先进化枝中,推测这些正选择作用分别与脊椎动物进化出后天免疫中的抗体和因此产生的补体系统的经典激活途径、哺乳类进化出复杂精细的补体调控系统、和鱼类在不同水体环境中进化出多种形式的C3分子有关。位点模型则在鱼类和哺乳类的C3中,分别发现了7个和0个正选择位点,表明哺乳类和鱼类的C3基因在进化模式上有差别,哺乳类C3经历纯化选择,而鱼类C3经历正选择作用,确实受到了水生环境中强大的生存压力带来的自然选择的影响,推测鱼类的补体C3在其适应水生环境的过程中发挥着重要作用。对鮸鱼补体C9的研究发现,其C9分子只编码N端的TSP,LDLRA和MACPF这3个结构域,而缺失了存在于其他所有硬骨鱼类C9分子C端的EGF和TSP2结构域,在硬骨鱼类中,还是首次发现截断形式的C9分子。应激实验表明,C9在肝脏的表达量是其他组织的千倍以上,表明肝脏是鮸鱼补体C9最重要的产生场所。而在感染后,肾脏的C9表达量上升了近50倍,是变化幅度最大的组织。位点模型在鱼类和哺乳类的C9基因中分别发现了0个和6个正选择位点,表明两者C9基因的进化模式也存在差别,但与C3结果有所不同,鱼类C9基因受到纯化选择压力,推测这可能与鱼类C9相对简单的功能有关;而哺乳类C9则受到正选择作用,表明哺乳类的先天免疫基因在陆生环境中仍然发挥重要作用。C3和C9进化分析结果表明,补体系统的不同成员在鱼类和哺乳类中的进化历史和进化模式也不尽相同。对鮸鱼TLR2基因结构的研究表明,鮸鱼的TLR2基因全长为5135bp,由12个外显子和11个内含子组成,其内含子和外显子数目均比红鳍东方鲀和墨绿凹鼻鲀的TLR2基因多1个。表明鮸鱼的TLR2基因发生了一次内含子插入事件,从而有利支持认为鱼类TLR2基因曾发生多次内含子插入事件的假说。应激实验表明,肾脏在感染后的表达量上升了6.5倍,是主要的应激组织。位点模型在哺乳类和鱼类的TLR2基因中都没有检测到正选择位点,表明两者的TLR2基因都受到强烈的纯化选择压力。
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