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动物药材是中药资源的重要组成部分。与植物药材相比,动物药材常为多基原,多缺乏专属性次生代谢产物。其基原不清、专属性鉴别手段缺乏,一直是动物药材鉴别的难点。近年来,随着分子鉴定技术的发展,多种DNA鉴别手段已用于动物药材的真伪鉴别,特异性PCR技术、DNA条形码技术等先后被《中国药典》收载,成为法定检测依据。然而,这些DNA鉴别方法难以兼顾通用性和特异性,且目前的这些DNA鉴别方法只关注“鉴真”的问题,无法检出是否同时存在混伪品,限制了其进一步推广及应用。本研究根据动物药材自身特点,基于STR分型原理,建立了一种简单易用,既具通用性又具特异性的通用DNA指纹图谱鉴别方法,用于动物药材正伪鉴别、正伪掺杂品鉴别与正伪掺杂品定量鉴别。主要研究内容和结果如下:一、2015年版《中国药典》一部收载的动物药材来源于14个纲78个物种。本研究首先对《中国药典》一部收载的动物药材进行全面收集(包括原动物样本、中检院的对照药材),本研究收集到了48味动物药材,59个物种。每个物种至少三个重复,共获得样品174批。样品经形态鉴别,并通过DNA测序佐证,以保证其物种基原的准确性。通过分析Genbank下载的57个动物药材全线粒体基因组序列,进行序列对齐后分析获得同源基因,从同源基因高变异区域两端保守序列设计出16对通用扩增引物,进行扩增成功率和荧光STR分型成功率测试,最终筛选出4对可在2015年版《中国药典》一部动物药材中成功获得STR分型鉴别图谱的通用引物对。用筛选出的引物对动物药材进行荧光STR分型,获得2015年版《中国药典》一部中动物药材物种DNA指纹图谱鉴别数据集,各物种具有不同的鉴别图谱,可相互鉴别。二、以胆粉类药材为例,阐述动物药材通用DNA指纹图谱鉴别方法对真伪及掺杂药材的鉴别应用。收集猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、蛇、熊、鱼原动物或胆粉样本,提取DNA,使用筛选出的荧光素标记的引物对12S-L1091/12S-H1478和16S-L3428/16S-H3667进行PCR扩增、荧光STR分型和数据分析。结果各物种的STR指纹图谱不同,可进行物种鉴别,且DNA指纹图谱上能同时反映正品和伪品的信息,可鉴别正伪掺杂品。混合样品STR图谱迁移峰具共显性,能够同时显示出多个扩增片段信息,且多个样本混合的多元掺杂胆粉样本(猪胆粉、牛胆粉、羊胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、蛇胆粉、鱼胆粉、熊胆粉)的鉴别中,DNA指纹图谱可以同时显示出各物种相应的迁移峰。三、以复杂的多基原地龙类药材鉴别为例,探索动物药材通用DNA指纹图谱鉴别方法在复杂近缘物种中的种属鉴别及对正伪掺杂样品的定量(半定量)鉴别潜力。收集地龙类药材(15个物种,175批样品),进行DNA提取后,用筛选出的三对通用DNA指纹图谱鉴别引物(12S-L1739/12S-H2175,12S-L1091/12S-H1478和16S-L3428/16S-H3667)对地龙类动物药材进行荧光STR分型和数据分析,获得DNA指纹图谱。结果4种地龙正品参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓使用以上三对引物分别出现389.7,396.2,394.7,391.4 bp(引物12S-L1739/12S-H2175);410.9,416.7,415.9,411.8 bp(引物12S-L1091/12S-H1478);162.8,164.1,164.2,163.7 bp(引物16S-L3428/16S-H3667)的迁移峰,11种伪品均出现与正品迁移位置不同的迁移峰,通过3对通用STR分型结果形成的DNA指纹图谱,可以准确鉴别地龙正品及混伪品的物种基原。按照11种不同的浓度比例将正品地龙与伪品地龙DNA混合,通过筛选出的引物12S-L1739/12S-H2175对其进行STR分型。再按照相同的浓度比例将正品地龙与伪品地龙的扩增产物混合并分型,作为混标结果。比较实际、混标实验DNA指纹图谱正品与伪品地龙峰面积比值与混合DNA浓度比值,结果混标实验比例更接近混合DNA的浓度比值。但总体上三者比例相似,实现了地龙类药材正伪掺杂品的定量鉴别。综上所述:本研究初步建立了2015年版《中国药典》一部动物药材通用DNA指纹图谱鉴别方法,并形成了参考DNA指纹图谱集,该方法可实现对动物药材正品、伪品及正伪掺杂品的DNA鉴别,并对正伪掺杂品定量鉴别进行了研究。该方法为动物药材的鉴定研究提供了新方法,为保障临床用药安全、有效奠定了良好基础。