论文部分内容阅读
胰岛素(insulin)是一类进化上十分保守的肽类激素,以降低血糖的能力而闻名,在生物体内具有调控生殖、代谢、发育等作用。而在昆虫体内也有着类似结构和功能的肽类激素,被称为“类胰岛素肽”(insulin-like peptides,ILPs)。东亚飞蝗是我国主要的农业害虫之一,在我国历史上多次对农业造成了巨大的损失。本文主要是通过克隆获得东亚飞蝗的ILP基因序列,并进行生物学信息分析。为了进一步探讨LmILP对东亚飞蝗繁殖与免疫的调控作用,主要通过注射外源胰岛素、RNAi技术和混合注射等处理方法,通过荧光定量PCR检测东亚飞蝗雌性蝗虫繁殖、免疫等相关基因,以及胰岛素信号通路、保幼激素信号通路等相关基因的表达情况的变化,同时检测酚氧化酶和溶菌酶的酶活力,另外根据卵巢称重来判断其对繁殖的影响。主要结果如下:(1)对已知的东亚飞蝗ILP序列进行生物学信息分析,找出了ILP的蛋白质二级结构和保守区域蛋白质三级结构。ILP的开放阅读框分别为438bp,编码145个氨基酸,预测的蛋白分子量为15.8 kD,预测的蛋白等电点为8.99。(2)通过实时荧光定量PCR技术,对不同处理的东亚飞蝗雌性成虫各信号通路相关基因的相对表达量进行了测定。结果表明,通过注射外源胰岛素后,东亚飞蝗IIS、JH信号通路各基因极显著下调,一些免疫受体基因表达极显著下调,抗菌肽基因表达显著上调,Vg表达极显著下调,其受体VgR表达极显著上调。在干扰ILP基因后,在IIS信号通路中LOCMI07679和LOCMI16380差异不显著,其余各基因的相对表达量表现为显著下调,FOXO表达上调,表明IIS受到抑制;JH信号通路中,JH的相对表达量极显著下调,Tai A和MCM7差异不显著,其余基因的相对表达量显著下调,表明JH信号通路受到抑制;免疫通路相关基因LOCM09346、LOCM10748、LmDEF3的表达量显著下调,其余基因差异不显著;繁殖相关基因中VgA、VgB、VgR1和VgR2的相对表达量均为极显著下调,表明东亚飞蝗的繁殖受到影响。在dsILP和胰岛素混合注射后,东亚飞蝗IIS中FOXO基因表达极显著上调,LmILP基因的表达极显著下调,表明在混合注射情况下,IIS被抑制,但是PI3K92E基因表达显著上调,说明IIS可能并未完全受到抑制,受到抑制的部分可能为IIS下游的调控通路基因;在混合注射下,东亚飞蝗JH信号通路中MET和20E的表达为极显著下调,MCM4的表达量为显著上调。混合注射下东亚飞蝗免疫相关基因中Toll receptor9基因极显著上调,Toll intreacting protein基因显著上调,但是Toll-like receptor6和LmDEF3、LmDEF4、LmDEF5的相对表达量极显著下调,可能是由于PI3K的激活,抑制了Toll-like receptor6和抗菌肽基因的表达。混合注射下东亚飞蝗繁殖相关基因Vg和VgR的表达量均表现为下降,说明东亚飞蝗繁殖基因是由IIS下游基因来调控的,IIS下游基因被抑制后,东亚飞蝗繁殖受到抑制。(3)对于东亚飞蝗卵巢发育,在注射外源胰岛素时,卵巢重量虽有上升但并不显著。在注射dsILP后,卵巢重量降低,但也不显著。但是外源胰岛素和dsILP混合注射时,东亚飞蝗的卵巢重量有显著性下降,可能的原因是在外源胰岛素和dsILP混合注射后,Vg和VgR的合成与吸收受到抑制。在酶活方面,只注射外源胰岛素时,蝗虫溶菌酶活力有显著下降,但是其酚氧化酶活力上升,但是无显著差异,表明在注射外源胰岛素后,东亚飞蝗的免疫受到了抑制;只注射dsRNA时,蝗虫溶菌酶活力和酚氧化酶活力均下降,说明干扰ILP会从酶活层次影响到蝗虫免疫;在外源胰岛素和dsILP混合注射下,蝗虫的溶菌酶和酚氧化酶活力极显著下降,表明混合注射下,加强了蝗虫的溶菌酶和酚氧化酶活力受到的抑制效果。