糖尿病是一类慢性的代谢性疾病,随着近年来其发病率的逐渐升高,糖尿病所导致的认知功能障碍也逐渐受到人们的重视,但是糖尿病认知功能障碍的发病机制尚不完全明确,因此,对糖尿病所导致的认知功能障碍的发病机制进行深入的探讨,将有益于合适的治疗策略的找寻。众多研究表明,炎症反应在糖尿病认知功能障碍中发挥了重要的作用。属于脂氧酶家族成员中的12/15-LOX即可以氧化花生四烯酸等游离脂肪酸,也直接氧化结合形式的多烯脂肪酸,参与机体多种炎症反应的发生,并通过调控炎症反应诱导细胞凋亡。本研究主要观察12/15-LOX在糖尿病认知功能障碍患者血浆以及糖尿病认知功能障碍大鼠脑组织中的表达变化,并初步探讨12/15-LOX-p38MAPK通路参与在糖尿病认知功能障碍及神经细胞损伤的机制。第一部分糖尿病患者血浆12/15-LOX水平与病人认知功能相关性初探目的:检测糖尿病患者认知功能以及血浆中12/15-LOX含量,初步明确糖尿病患者认知功能与患者血浆12/15-LOX水平的相关性。方法:根据糖尿病的诊断标准,制定纳入/排除标准,于2017年4月-2017年7月从贵州省人民医院就诊的患者中收集符合糖尿病入组标准的糖尿病患者以及正常人群的血浆标本。用简易认知功能量表对糖尿病患者及正常人群进行测评,采用ELISA法测定人血浆中的12/15-LOX含量。结果:1.共收集了38例临床标本,年龄没有明显差异,其中有24例符合糖尿病诊断标准,在这些糖尿病患者中有12名糖尿病患者简易认知功能量表测评分数低于27分,并在定向力（9.08±0.67）vs（9.86±0.36）、记忆力（2.33±0.65）vs（2.93±0.27）及计算能力（3.42±0.51）vs（4.71±0.47）方面较正常对照组明显下降（P<0.05）。2.简易认知功能量表得分小于27分的糖尿病患者血浆中12/15-LOX含量（144.2±4.585）明显高于正常对照组（49.54±2.672）。结论:糖尿病认知功能障碍患者血浆中12/15-LOX含量明显升高,结果初步提示糖尿病认知功能障碍的发生可能与血浆中12/15-LOX含量升高有关。第二部分12/15-LOX表达/激活对糖尿病大鼠脑损伤/认知功能障碍的影响目的:观察12/15-LOX在糖尿病认知功能障碍大鼠脑组织中的表达改变,并初步明确12/15-LOX表达/激活与糖尿病大鼠脑损伤/认知功能障碍发生的相关性。方法:1.选取雄性SD大鼠60只,体重80-100g,随机选择10只作为正常对照组,50只大鼠予以高脂高糖饮食诱导一月后联合40mg/kg STZ（100g/1ml）腹腔注射进行糖尿病造模。随机选取造模成功的大鼠30只分为三组:模型组,模型+Baicalein高剂量组(100mg·kg^-1)和模型+Baicalein低剂量组(50mg·kg^-1)每组各10只,各组均灌胃给予相应药物,正常组、模型组给予0.5%CMC-Na继续喂养八周。2.采用血糖仪测定大鼠空腹血糖水平;Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆功能;HE染色观察大鼠海马及皮层神经细胞形态;生化酶学测定大鼠血浆中TC、TG和LDL的水平,ELISA测定大鼠血浆中胰岛素的含量和大鼠脑组织中CRP,IL-6,TNF-α以及12（S）-HETE含量;Western blotting测定大鼠海马及皮层中12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9、Bcl-2以及cPLA2蛋白的表达。结果1.与正常组相比,模型组大鼠空腹血糖和随机血糖水平明显高于正常组大鼠血糖（P<0.05）;血浆TG、TC水平显著性升高（P<0.05）,LDL水平没有明显变化（P>0.05）。水迷宫实验显示,与正常组相比,模型组大鼠的寻台潜伏期明显延长（P<0.01）,穿梭次数减少（P<0.01）。HE染色显示糖尿病大鼠海马及皮层的神经元均出现明显的细胞核固缩和核深染。ELISA结果显示,与正常组相比,模型组大鼠血浆中胰岛素含量明显降低,海马及皮层中TNF-α,IL-6及12（S）-HETE的含量明显升高（P<0.05）,CRP含量的变化没有统计学差异（P>0.05）;模型组大鼠海马及皮层中12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9及cPLA2蛋白表达明显升高（P<0.01&P<0.05）,Bcl-2的表达明显降低（P<0.05）2.与模型组相比,给予12/15-LOX抑制剂Baicalein的糖尿病大鼠空腹血糖和随机血糖,LDL的水平以及血浆中胰岛素含量变化没有明显变化、TC、TG水平变化没有统计学差异;寻台潜伏期时间明显缩短（P<0.01）,穿越平台次数显著增加（P<0.05）,并具有剂量依赖性;海马及皮层TNF-α,IL-6和12（S）-HETE的含量明显下降（P<0.05）;海马及皮层12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9及cPLA2的蛋白表达明显降低,而Bcl-2明显升高,差异具有剂量依赖性（P<0.01&P<0.05）。结论:1.糖尿病大鼠海马及皮层神经元损伤,大鼠出现认知功能障碍,脑组织中12/15-LOX、p38MAPK表达增加。2.Baicalein对糖尿病大鼠认知功能障碍有明显保护作用,其机制可能涉及抑制12/15-LOX活性,降低脑内12/15-LOX表达,下调p38MAPK表达,减少Aβ_1-42的生成,减轻炎症反应,调节细胞凋亡相关蛋白表达。第三部分12/15-LOX表达/激活对高糖负荷致HT22细胞损伤的影响目的:观察高糖负荷下HT22细胞12/15-LOX的表达变化;采用12/15-LOX抑制剂/shRNA转染、p38MAPK抑制剂干预,观察12/15-LOX-p38MAPK信号通路对高糖负荷致HT22细胞损伤的影响。方法:1.12/15-LOX在高糖负荷HT22细胞的表达变化:（1）高糖负荷HT22细胞模型建立:不同浓度的高糖培养基（25mM,50mM,75mM以及100mM）作用于HT22细胞6h-36h,MTT法测定细胞的存活率;生化试剂盒测定LDH漏出率;倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪测定细胞凋亡,以确定HT22高糖负荷模型的浓度及处理时间。（2）利用建立的高糖负荷HT22细胞模型,采用Western blotting测定高糖负荷下HT22细胞12/15-LOX和p38MAPK的表达。2.12/15-LOX抑制剂对高糖负荷HT22细胞损伤的作用观察:（1）不同浓度Bacailein作用于高糖负荷HT22细胞,MTT法测定细胞存活率,生化试剂盒测定LDH漏出率,确定Baicalein对高糖负荷HT22细胞损伤的保护作用。（2）根据Bacailein最佳给药浓度,将细胞分为正常组,模型组和Baicalein给药组,qPCR方法测定细胞中12/15-LOX和p38MAPK mRNA的表达;细胞免疫荧光和Western blotting测定细胞中12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9、Bcl-2以及cPLA2蛋白的表达。3.12/15-LOX调控p38MAPK参与高糖负荷致HT22细胞损伤机制观察:（1）12/15-LOX shRNA转染HT22细胞,荧光显微镜及Western blotting观察转染细胞12/15-LOX的表达。（2）12/15-LOX shRNA对高糖负荷HT22细胞的影响:实验分为正常组,正常+空载病毒组,高糖负荷模型组,模型+空载病毒组,模型+12/15-LOX shRNA转染组。MTT法测定HT22细胞存活率,Western-blotting测定细胞12/15-LOX、p38MAPK、Phospho-p38MAPK、Aβ_1-42、caspase-3、caspase-9和Bcl-2蛋白的表达。（3）12/15-LOX shRNA联合p38MAPK抑制剂对高糖负荷致HT22细胞损伤的影响:实验分为正常组,模型组,模型+12/15-LOX shRNA组,模型+p38MAPK抑制剂组,模型+12/15-LOX shRNA+p38MAPK抑制剂组。MTT法测定细胞存活率,Western-blotting的测定细胞12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9和Bcl-2蛋白的表达。结果:1.12/15-LOX在高糖负荷HT22细胞的表达变化:（1）与正常组相比,不同浓度的葡萄糖作用于HT22细胞36h细胞存活率明显下降（P<0.05）,而LDH漏出率明显增加（P<0.01）,细胞早期凋亡率增加。为了HT22细胞损伤合适比例,我们选择75mM葡萄糖处理36h作为高糖负荷HT22细胞模型建立条件;（2）Western blotting显示与正常组相比,75mM葡萄糖处理HT22细胞36h,细胞12/15-LOX和p38MAPK蛋白表达明显升高（P<0.05）。2.12/15-LOX抑制剂对高糖负荷HT22细胞损伤的作用观察:（1）与正常组相比,模型组的HT22细胞存活率明显降低,LDH漏出率增加。与模型组相比,Baicalein能够显著提高高糖负荷下细胞存活率（P<0.05）,降低LDH漏出率（P<0.01）,并呈剂量依赖性。（2）与正常组相比,模型组HT22细胞12/15-LOX、p38MAPK mRNA的表达增高（P<0.05）;12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、caspase-3、caspase-9以及cPLA2蛋白表达均明显升高（P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达减少（P<0.05）。与模型组相比,Baicalein（3μmol/L）干预,高糖负荷HT22细胞12/15-LOX和p38MAPK mRNA的表达降低（P<0.05）,12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9以及cPLA2蛋白表达也明显降低（P<0.01&P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达明显增高（P<0.05）。3.12/15-LOX调控p38MAPK参与高糖负荷致HT22细胞损伤机制观察:（1）慢病毒载体可以将12/15-LOX shRNA稳定转染于HT22细胞,与正常组相比,shRNA转染后能够降低HT22细胞12/15-LOX和p38MAPK的表达（P<0.05）。（2）与正常组相比,高糖负荷模型组细胞存活率降低（P<0.05）,与模型组相比,12/15-LOX shRNA转染能够后能够提高高糖负荷HT22细胞存活率（P<0.05）,而空载病毒对细胞存活率没有影响;12/15-LOXshRNA转染能明显降低高糖负荷HT22细胞12/15-LOX、p38MAPK、Aβ_1-42、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9的表达（P<0.05）,升高Bcl-2蛋白的表达（P<0.05）,空载病毒转染没有明显影响。（3）与高糖负荷模型组相比,12/15-LOX shRNA转染联合p38MAPK抑制剂干预,能明显提高高糖负荷HT22细胞存活率,降低12/15-LOX、p38MAPK、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9与Aβ_1-42蛋白表达（P<0.01）。12/15-LOX shRNA转染联合p38MAPK抑制剂干预对高糖负荷HT22细胞存活率的影响,明显优于模型+p38MAPK抑制剂组;对p38MAPK、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9及Aβ_1-42的表达的影响明显优于模型+单纯p38MAPK抑制剂组。结论:1.75mM葡萄糖作用于HT22细胞36h可以成功建立高糖负荷致HT22细胞损伤模型;高糖负荷HT22细胞12/15-LOX及p38MAPK表达明显增加。2.12/15-LOX抑制剂/shRNA能够提高高糖负荷HT22细胞存活率,下调12/15-LOX、p38MAPK、caspase-3、caspase-9、cPLA₂和Aβ_1-42在高糖负荷HT22细胞的表达,上调Bcl-2的表达。3.12/15-LOX表达/激活通过调控p38MAPK,影响Aβ_1-42的生成,影响凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和Bcl-2的表达可能是高糖负荷致HT22细胞损伤的机制之一。