论文部分内容阅读
后肠是湖羊消化道内的重要器官,其功能涉及参与机体消化和吸收从外界摄入的营养物质。在高精料日粮模式下,瘤胃微生物菌群结构与上皮形态及功能发生改变,以适应该饲喂模式,但湖羊后肠道到底通过何种机制适应高精料日粮饲喂模式,目前并不十分清楚。本文通过动物试验,研究了在突然提高日粮精料比例的情况下,湖羊结肠微生物发酵、上皮形态和功能以及微生物区系对高精料日粮的动态适应性应答过程与机制。全文包括以下三部分。1.湖羊结肠发酵及上皮形态和功能对高精料日粮的适应性应答本试验旨在探究在突然大幅度提高日粮中精料比例的情况下,湖羊结肠微生物发酵、上皮形态和功能对其产生的动态适应性应答过程。选取20头湖羊,随机分成四组,每组5头,即干草对照组（CON,只喂粗饲料）和高精料组（HG7、HG14和HG28,高精料日粮分别饲喂7、14和28天）。试验结束后,屠宰采取湖羊结肠内容物及黏膜组织样品进行分析。结果表明,随饲喂高精料日粮的时间的增加,结肠pH线性下降（P=0.007）,乙酸（P<0.001）、丙酸（P<0.001）、丁酸（P<0.001）、TVFA（P<0.001）和乳酸（P=0.015）的浓度线性增加;丁酸占TVFA的比例随饲喂时间的增加而线性增加（P<0.001）,异丁酸（P<0.001）、异戊酸（P<0.001）和戊酸（P=0.001）的比例则随时间线性下降。组织学形态结果显示,与CON组相比,HG7组湖羊结肠上皮细胞间隙明显变大,结构松散,出现脱落现象,而HG14组和HG28组湖羊结肠上皮呈现修复的趋势。紧密连接蛋白定量结果显示,饲喂高精料日粮显著改变了claudin-4基因的表达量（P<0.001）:与CON组比较,HG7组湖羊结肠该基因表达量下调（P=0.038）,HG14组该基因的mRNA表达显著上调并高于CON组（P=0.004）,HG28组该基因表达下调并恢复至CON组水平（P=0.664）。结肠上皮细胞增殖与凋亡相关基因的表达结果表明,与CON组比较,饲喂高精料日粮降低了CDK-1（P=0.011）、CDK-6（P=0.016）和cyclin-E（P=0.029）基因的表达。饲喂高精料日粮显著改变了caspase-8基因（P=0.046）和caspase-3基因（P=0.025）的表达量:与CON组相比,HG7组caspase-8基因的表达量上调（P=0.027）,而HG14组和HG28组该基因的表达量下调并恢复至CON组水平（P>0.05）;与CON组相比,HG7组caspase-3基因的表达量无差异（P=0.291）,而HG14组和HG28组该基因的表达量显著下调并低于HG7组（P<0.05）。结肠上皮VFA吸收与代谢相关基因定量结果说明,与对照组相比,饲喂高精料日粮导致NHE-3（P=0.020）和BDH-1（P=0.010）的mRNA表达量显著下调。HG28组PAT-1（P=0.023）和HMGCS-1（P=0.028）基因的mRNA表达量显著低于CON、HG7和HG14组。饲喂高精料日粮显著改变了湖羊结肠黏膜MCT-1的mRNA表达量（P=0.013）:与CON组相比,HG7组的MCT-1的表达量显著降低（P=0.016）,HG14组和HG28组该基因的表达量逐渐恢复并与CON组无显著差异（P>0.05）。随后该基因的表达量逐渐增加,在HG28组恢复至CON组水平（P=0.013）。以上结果说明,高精料日粮促进了湖羊结肠发酵,结肠上皮形态及功能对高精料产生适应性应答,该应答在四周时间内持续进行。2.湖羊结肠内容物细菌菌群对高精料日粮的适应性应答本试验旨在研究湖羊结肠内容物微生物菌群对高精料日粮的适应性应答。试验设计同第1部分,试验结束后,采集结肠内容物提取微生物DNA,用于高通量测序和Real-time PCR定量。测序结果表明,在饲喂高精料日粮的过程中,结肠内容物菌群的多样性线性持续下降（P<0.001）,四组内容物的细菌菌群结构与组成发生显著改变。在结肠内容物样品中,共检测到18个门,日粮因素及饲喂时长显著改变了7个门的相对丰度。在属水平上,高精料日粮显著降低了结肠内容物Akkermansia、unclassified Clostridiales、unclassified BSllgutgroup、Desulfovibrio和unclassified Bacteroidales 的相对丰度（FDR<0.05）,显著提高了 unclassified Lachnospiraceae、Coprococcus、unclassified Erysipelotrichaceae、Prevotella、Anaerostipes 和Clostridiumsensustricto1的相对丰度（FDR<0.05）,高精料日粮饲喂时长对以上菌属无显著影响（FDR>0.05）。随饲喂高精料日粮时间的增加,Ruminococcus、Roseburia和Bifidobacterium的比例呈持续动态变化（FDR<0.05）。以上结果说明,高精料日粮显著改变了结肠内容物微生物区系的组成与结构,降低了后肠微生物菌群的多样性与丰度;在饲喂高精料日粮后的4周内,结肠内容物的微生物区系未能达到稳定状态。3.湖羊结肠黏膜附着菌群及炎性细胞因子基因表达对高精料日粮的适应性应答本试验旨在探讨湖羊结肠附着菌群及炎性细胞因子基因表达对高精料日粮的适应性应答过程。试验设计同第1部分,试验结束后,采集结肠黏膜提取微生物DNA,采集结肠黏膜上皮提取RNA,用于高通量测序和炎性细胞因子基因表达的定量。测序结果表明,在饲喂高精料日粮的过程中,结肠黏膜菌群的多样性线性下降（P<0.001）,四组黏膜样品的微生物菌群结构与组成发生显著改变。在结肠黏膜样品共检测到21个门的微生物,日粮因素及饲喂时长显著改变了 7个门的相对丰度。在属水平上,高精料日粮显著降低结肠黏膜中Treponema（FDR=0.016）的相对丰度,显著提高了Prevotella、Oscillibacter、Acetitomaculum、Anaerostipes 和Clostridium<sub>sensustricto1等菌属的比例（FDR<0.05）,高精料日粮饲喂时长对以上菌属的丰度无显著影响（FDR>0.05）。随高精料日粮饲喂时间的增加,Roseburia、unclassified Lachnospiraceae、Butyrivibrio、Bifidobacterium和Helicobacter等分类单元的相对丰度持续变动（FDR<0.05）。Real-time PCR定量结果显示,附着在HG28组湖羊结肠黏膜上的总菌（P=0.024）、厚壁菌门（P=0.002）和拟杆菌门（P=0.002）微生物的数量显著低于CON组、HG7组和HG14组,而CON组、HG7组和HG14组之间无显著差异（FDR>0.05）。较对照组相比,饲喂高精料日粮显著提高了IL-1β（P=0.039）、TNF-α（P=0.050）和TLR-3（P=0.044）基因的 mRNA 表达量。相关性分析结果显示,湖羊结肠黏膜的TNF-α的mRNA表达量与结肠pH呈显著负相关（r=-0.517,P=0.020）,而IL-1β（r=0.672,P=0.001）和 TNF-α（r=0.617,P=0.004）基因的表达量与Clostridiumsensustricto1的相对丰度呈显著正相关。结果说明,高精料日粮显著改变了结肠黏膜微生物区系的组成与结构,诱发后肠上皮炎性反应,在饲喂高精料日粮后的4周内,粘附在结肠上皮的微生物菌群未能达到稳定状态。