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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Cry2类蛋白对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性,并且与目前广泛应用于转基因作物中的Cry1类蛋白无交互抗性,是转基因抗虫作物重要的候选蛋白。目前,获得命名的cry2类基因共有94个,分为13类模式基因(cry2Aa-cry2Al,cry2Ba)。Cry2类蛋白具有序列相似性高,但是杀虫活性、杀虫谱及蛋白表达差异较大的特点。本研究重点围绕cry2类基因的表达特性开展研究,分析诱导温度、氨基酸序列差异、分子伴侣等因素对Cry2类蛋白表达的影响。具体包括本实验室克隆的五种模式的7个cry2类基因(cry2Aa9、cry2Aa17、cry2Ab4、cry2Ab29、cry2Ad2、cry2Ba2、cry2Ah1),分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌中进行了不同条件的表达,主要进展如下:1.分析了相同诱导条件下,不同cry2类基因在大肠杆菌中的表达情况。分别比较了20℃和30℃诱导下Cry2类蛋白表达量差异。其中Cry2Ah1蛋白的表达量均最高。通过比对Cry2Ah1蛋白与其它蛋白的氨基酸序列及三维结构差异,发现Cry2Ah1蛋白位于DomainⅡβ4与β5之间loop上的第355位缺失了1个氨基酸。对Cry2Ah1蛋白的增加氨基酸突变体Cry2Ahs(354位v变为s,355位添加p)、Cry2Ahv(355位添加p)进行相同条件诱导表达,这两种突变体的蛋白表达量显著低于Cry2Ah1蛋白,从而证实了Cry2类蛋白表达量与DomainⅡβ4与β5之间loop上的氨基酸数量密切相关。2.比较了在不同温度诱导下,在大肠杆菌中表达的7种Cry2类蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的杀虫活性,其中Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1四种蛋白对甜菜夜蛾有活性。在20℃诱导的条件下,蛋白浓度为100μg/mL时,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白对甜菜夜蛾的体重抑制活性分别为42.74%、89.18%、87.02%、85.28%;在30℃诱导的条件下,蛋白浓度为100μg/mL时,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白对甜菜夜蛾的体重抑制活性分别为0、43.72%、47.48%、70.54%;结果表明Cry2类蛋白的活性受温度影响,且Cry2Ah1蛋白的活性受温度影响较小。3.对实验室先前构建的Cry2Aa蛋白Bt表达载体pHT315-cry2AΔo1进行了改造。通过定点突变的方法将ClaⅠ和NcoⅠ酶切位点引入cry2Aa基因两端,利用同源重组的方法构建9种cry2类基因的Bt重组表达载体;导入Bt HD73~-无晶体突变株后,9种蛋白均获得表达。比较了各重组菌对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、小菜蛾(Plutella xylostella)、东方粘虫(Mythimna separata)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物活性,除Cry2Aa9重组菌有活性外,其它重组菌均无明显活性。4.比较了Bt表达载体中分子伴侣ORF1、ORF2对Cry2类蛋白表达量及蛋白溶解性的影响。在分子伴侣ORF1、ORF2同时存在的情况下,Cry2类蛋白表达量显著高于ORF2单独存在,但是ORF1、ORF2同时存在对Cry2类蛋白在碱性溶液中的溶解性无显著影响。此进展为进一步改造Cry2类蛋白序列、提高蛋白表达及杀虫活性奠定了基础。