近四十年来,稻曲病在世界各主要水稻栽培区表现出发生规模不断扩大、严重程度不断增加的态势,并逐渐发展成为水稻主要病害。浙江省已经成为我国稻曲病发生的重灾区。本实验室近年来的研究表明,在秋季温度偏低的年份和成熟偏晚的水稻病穂上,浙江省稻田可形成大量的稻曲病菌菌核。本研究通过应用转录组高通量测序和丝状真菌基因敲除等技术,探索低温对稻曲病菌菌核形成的分子机制并进行了初步研究,并取得了以下主要结果。1.田间调查发现,2017年浙江省秋季气温相对常年偏高,只有发育迟缓的自生水稻苗有稻曲病的发生;而越晚熟的水稻自生苗发病越严重,所产生的菌核数量也越多。说明在秋后温度偏低时遇上成熟偏晚的水稻,更加有利于稻曲病的发生。对随机采集的120个稻曲球进行横切片,发现16个具有隐含菌核的稻曲球,比例约为13.56%。进一步的解剖观察发现,菌核的确是从稻曲球内部分化出来的,其产生的时间是稻曲球发育的中后期。低温可促进稻曲病菌菌核的分化。2.萌发试验表明,只有新鲜的厚垣孢子才能够正常萌发,低温保存一年或是模拟田间越冬环境沙土培养的稻曲球其厚垣孢子都不能够正常萌发。隐含的未成熟菌核也不能萌发形成子实体。由此可以推断,只有成熟的稻曲病菌菌核才是来年稻曲病发生的主要初侵染源。3.采用高通量测序技术对低温处理的稻曲球进行基因表达分析,共获得59.78 G测序数据,得到了4845个差异表达基因,其中2504个基因受低温诱导显著上调,2341个基因显著下调。随后对差异表达基因进行GO富集分析发现,在分子功能的分类中,氧化还原酶类基因在低温处理稻曲病菌中显著上调。结合KEGG代谢通路,差异基因还主要参与了次生代谢产物生物合成、淀粉和蔗糖代谢等营养物质代谢和能量代谢途径。进一步对差异基因进行深度挖掘,稻曲菌丝形成菌核可能是低温环境胁迫诱导所致,让机体内部处于氧化应激状态,并通过信号传导途径的放大,调控了跨膜运输、细胞形态、生物合成等基因的上调表达,使得在菌核形成过程中蛋白表达活跃,达到合成细胞及物质的高峰期,进而促进菌核形成。4.通过上述转录组数据分析,筛选出了7个可能与稻曲病菌菌核形成相关的基因,然后利用PEG介导的原生质体转化技术敲除目的基因并进行突变体的致病性分析。其中得到了2个稻曲病菌UvVEA基因缺失的突变体菌株。对突变体菌株的生物学特征分析发现,所有突变菌株不仅在生长前期菌丝生长缓慢,产孢能力下降,萌发时芽管生长速率降低,另外还对H₂O₂非常敏感。人工接种试验表明,突变体致病性丧失,没有成功侵染并产生菌核。而野生菌株致病性良好,并且有67%的稻曲球产生了菌核。以上结果说明,该基因与稻曲病菌的致病性和菌核形成均有密切关系。