在现实生活中时常会遇到在遭受重大心理应激后发生精神障碍甚至死亡的案例。例如:在遭受电信诈骗而受到强烈心理应激原刺激突发死亡;因欠债被债权人控制束缚限制体位发生死亡;因贪污受贿突然被羁押出现精神障碍甚至死亡;因目睹惨烈交通事故或者自然灾害而发生精神障碍。上述案件有着显著的共同特点,即均存在明确的心理应激及躯体应激因素。我国司法鉴定对在遭受强烈心理应激或躯体应激后导致的机体损伤及精神障碍的评估及鉴定还无确切的标准,应激导致的精神损伤乃至死亡机制仍尚不清楚。因缺乏科学依据,故难以客观公正地对上述案件进行评估鉴定,使案件的处理陷入僵局,造成不良的社会影响。因此,研究应激导致的精神损伤机制是法医学亟待解决的重大科学问题。中枢神经系统与应激最密切相关,揭示应激导致的中枢神经系统病理性改变机制的基础研究尤为重要。流行病学调查显示,51.2%-60.7%的人一生中至少经历过一次重大心理应激事件,说明心理应激是人生体验的一部分。经历重大心理应激后约7%的人可能会发生精神障碍,严重影响生活质量和社会活动能力。既往研究表明经历战争的士兵在恐惧性刺激时杏仁核和脑岛激活水平明显升高。对出征前后士兵大脑功能与结构性神经网络连接进行比较,发现出征前后大脑杏仁核和内侧额叶等功能发生显著变化。911恐怖袭击发生三年后,研究者发现目击者的杏仁核、海马、前扣带和前额叶皮层的体积显著减小,表明杏仁核体积减小和遭遇的生活事件呈显著地正相关。2008年汶川大地震后对幸存者的研究发现,地震25天包括杏仁核在内的多脑区兴奋程度增加伴功能连接下降。说明严重而持续的应激导致杏仁核在形态结构和功能方面均发生了明显的变化,因此研究杏仁核在应激刺激后的变化机制是重要的科学问题。杏仁核(Amygdala)作为大脑边缘系统的关键组成部分,在恐惧性情感形成和表达过程中发挥着不可或缺的作用。杏仁核基底外侧核(Basolateral nucleus,BLA)已被大量的研究证实在恐惧性情绪的学习和记忆中发挥着重要的作用,同时作为恐惧性神经环路中的关键结构,受到广泛关注。杏仁核在未受到应激刺激的静息状态下呈现出明显的高抑制状态,其自发性放电活动明显弱于周边脑区,但是在应激性精神障碍病人中发现杏仁核却处于持续过度的兴奋状态。应激导致杏仁核静息功能状态的改变,与其E/I平衡(balance of excitation and inhibition)紊乱有关,同时脑内E/I平衡紊乱还是焦虑症产生的内在原因。γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作为BLA区最重要的抑制性神经递质,其参与应激导致的E/I失衡的机制目前尚未完全阐明。因此本研究旨在探明应激导致的杏仁核病理性改变及E/I失衡机制与杏仁核神经细胞(包括GABA能神经细胞)损伤的相关关系。我们前期研究初步证实较长时程的应激可导致大鼠下丘脑神经细胞的变性死亡,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)相关蛋白可能参与了下丘脑神经细胞的损伤过程。ERS是应激细胞发挥自我保护的一种机制,较长时程过度的ERS可造成细胞的病理性改变。有研究证实ERS在神经退行性疾病导致的神经细胞损伤和发病机制中发挥重要作用。缺氧、缺血、能量代谢障碍均可诱发ERS的发生。发生ERS时,内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)与未折叠或错误折叠蛋白结合,从而使其与内质网跨膜蛋白受体双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、1型跨膜蛋白激酶(inositol requirement 1,IRE1)和激活作用转录因子6(artificial transcription factor 6,ATF6)解离,从而激活这三条信号通路,促进蛋白质的正确折叠,发挥对细胞的保护作用。但是持续过度的内质网应激可损害内质网功能,PERK和ATF6的启动又会促进生长抑制因子(C/EBP homologous protein,CHOP)的激活,增加其表达量,CHOP的高表达使得内质网应激达到顶峰,可诱导细胞损伤的发生。caspase12作为ERS反应时诱导细胞损伤的关键分子,仅在ERS时被激活,而在线粒体或死亡受体凋亡过程中却不被激活。caspase12从无活性酶原的形式发生重组,切割并激活caspase 9酶原,继而启动caspase3。研究表明,caspase3可以启动凋亡程序,引起细胞凋亡;也可以通过裂解蛋白,产生多种片段,对细胞造成损伤,引起神经细胞变性死亡。因此,caspase12被认为是ERS的标志性分子;caspase12和caspase3在导致细胞损伤中具有重要作用。本研究旨在探明在应激导致的杏仁核BLA区神经细胞损伤中是否存在ERS的参与。在众多复制应激的动物模型中,束缚应激是一种不可逃避性心理应激模型;冰水游泳则既具有躯体应激,也具有心理应激。本研究采用束缚加冰水游泳的应激模型,以模拟司法实践中复杂的应激情况。本研究在建立束缚加冰水游泳应激大鼠模型的基础上,系统观察大鼠的精神行为学、神经内分泌、神经病理学及ERS相关蛋白的表达变化,探讨应激所致的杏仁核BLA区神经细胞病理变化与神经内分泌以及精神行为学之间的相关关系,阐明应激导致杏仁核BLA区神经细胞病理性改变的参与机制。为应激导致的精神疾病的评估及法医病理学鉴定提供理论支持,也可为应激性精神障碍的治疗提供新的治疗靶点。第一部分应激导致大鼠杏仁核基底外侧核神经细胞损伤目的:在成功建立束缚加冰水游泳应激大鼠模型的基础上,观察应激大鼠行为学改变及相关神经递质的变化;通过HE染色、硫堇染色及可特异性标记变性死亡神经细胞的Fluoro-Jade B荧光标记染色和免疫组织化学方法,观察杏仁核BLA区神经细胞的病理学改变。方法1采用束缚加冰水游泳建立应激大鼠模型。通过自发活动和高架十字迷宫观察应激行为学改变。2酶联免疫吸附实验检测血清及杏仁核儿茶酚胺以及ATP的含量;采用液相色谱-质谱联用法检测杏仁核GABA和GLU及其衍生物的含量;观察大鼠神经内分泌的改变。3通过HE染色、硫堇染色和Fluoro-Jade B荧光染色和免疫组织化学方法观察大鼠杏仁核BLA区神经细胞的病理学改变。结果1.自发活动及高架十字迷宫观察到应激大鼠与对照组相比出现明显焦虑样行为(P<0.05),且随应激时间的延长,症状逐渐加重(P<0.01)。2.应激大鼠血清儿茶酚胺含量于应激第1天迅速升高(P<0.01),其后呈逐渐下降,应激第21天血清儿茶酚胺仍较对照组明显升高(P<0.05)。应激大鼠杏仁核肾上腺素和去甲肾上腺素则于应激后缓慢逐渐升高,于应激第1天与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。应激大鼠杏仁核ATP含量于应激后呈逐渐下降趋势,于应激后第1天与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。3.杏仁核GLU于应激后持续增高,于应激第3天较对照组明显升高(P<0.05),第7天达高峰,其后略有下降,但较对照组仍显著升高(P<0.01);杏仁核GABA于应激后短期内出现波动,第7天较对照组明显下降(P<0.05)。GLU/GABA比值于应激后第3天较对照组显著升高(P<0.01),并随应激时间延长比值逐渐增大。4.HE染色结果表明随着应激时间的延长,杏仁核BLA神经细胞逐渐出现神经细胞水肿,组织结构疏松,神经细胞固缩,小胶质细胞增生,并出现卫星现象和嗜神经现象。5.硫堇染色结果表明随着应激时间的延长,杏仁核BLA神经细胞逐渐出现结构不清,尼氏体排列不规则、消失,细胞固缩深染等现象,并可见卫星现象。6.Fluoro-Jade B染色结果表明杏仁核BLA神经细胞发生了变性死亡,且随着应激时间的延长,变性死亡的神经细胞逐渐增多。7.运用GABA能神经细胞特异性标记蛋白GAD65/67,通过免疫组织化学染色结果表明长时程应激可导致杏仁核BLA区GABA能神经细胞比例下降。小结1.应激可导致大鼠杏仁核BLA区神经细胞的变性死亡。2.应激导致的大鼠杏仁核E/I失衡可能与杏仁核BLA区神经细胞的变性死亡有相关关系。第二部分儿茶酚胺介导应激大鼠杏仁核基底外侧核神经细胞损伤机制研究目的:腹腔注射酪氨酸羟化酶抑制剂(alpha-methyl-p-tyrosine,AMPT),通过抑制儿茶酚胺生成,对比观察抑制前后血清及杏仁核儿茶酚胺水平、神经递质以及ATP含量变化。HE染色、硫堇染色及Fluoro-Jade B荧光标记观察抑制前后杏仁核BLA区神经细胞病理学改变差异及caspase12、caspsae3的表达变化,探讨应激大鼠是否通过儿茶酚胺介导了杏仁核BLA区神经细胞(包括GABA能神经细胞)的损伤及与caspase12、caspsae3的相关关系。方法1造模前给予腹腔注射AMPT,采用束缚加冰水游泳建立应激大鼠模型。通过自发活动和高架十字迷宫观察应激大鼠行为学改变。2酶联免疫吸附实验检测大鼠血清及杏仁核儿茶酚胺及ATP的含量;采用液相色谱-质谱联用法检测杏仁核GABA和GLU及其衍生物的含量。3通过HE染色、硫堇染色和Fluoro-Jade B荧光染色观察大鼠杏仁核BLA区神经细胞的病理学改变。4通过免疫组织化学观察杏仁核BLA区GABA能神经细胞的表达;免疫组织化学观察大鼠杏仁核BLA区神经细胞caspase12、caspase3的表达。5运用Western blot检测大鼠杏仁核caspase12、caspase3蛋白的表达。6通过免疫荧光多重标记观察杏仁核BLA区神经细胞中caspase12、caspase3与GAD65/67的共表达阳性神经细胞数量。结果1.自发活动及高架十字迷宫观察到stress+AMPT组与stress组大鼠相比焦虑样行为程度明显减轻(P<0.05),但与对照组和AMPT组相比仍有焦虑样行为改变(P<0.05)。2.stress+AMPT组大鼠血清儿茶酚胺含量明显低于stress组大鼠(P<0.05),但与对照组相比没有统计学差异。stress+AMPT组杏仁核去甲肾上腺素较stress组明显下降(P<0.05),但较对照组仍明显升高(P<0.01)。stress+AMPT组杏仁核ATP含量较stress组明显提高(P<0.05),但与对照组相比仍稍降低(P<0.05)。3.stress+AMPT组杏仁核GLU含量明显低于stress组(P<0.01);GABA含量显著高于stress组(P<0.01),能有效改善GLU/GABA比值。4.HE染色结果表明stress+AMPT组杏仁核BLA区神经细胞固缩数量,小胶质细胞增生程度与stress组相比明显减轻。5.硫堇染色结果表明stress+AMPT组杏仁核BLA区神经细胞变性现象较stress组相比明显减轻。6.Fluoro-Jade B染色结果表明stress+AMPT组杏仁核BLA区神经细胞变性死亡数量较stress组明显减少(P<0.01);但与对照组相比仍有所增多(P<0.01)。7.免疫组织化学染色结果显示stress+AMPT组杏仁核BLA区神经细胞caspase12、caspsae3表达量较stress组相比明显降低(P<0.01);但与对照组相比仍明显升高(P<0.01)。8.Western blot检测蛋白半定量结果显示,stress+AMPT组杏仁核caspase12、caspsae3表达量与stress组相比降低(P<0.05);但与对照组相比仍有所增加(P<0.05)。与免疫组织化学染色结果基本一致。9.杏仁核BLA区GABA能神经细胞GAD65/67与caspase12、caspsae3免疫荧光多重标记(激光共聚焦)显微镜观察:stress+AMPT组GAD65/67与caspase12、caspsae3共表达的阳性神经细胞数量较stress组明显减少(P<0.05)。10.GAD65/67免疫组织化学染色结果显示,stress+AMPT组杏仁核BLA区GABA能神经细胞数量较stress组明显增多(P<0.05)。小结1.酪氨酸羟化酶抑制剂AMPT可降低应激大鼠血清以及杏仁核儿茶酚胺水平,改善杏仁核E/I比值,能有效地改善应激大鼠焦虑样行为;2.酪氨酸羟化酶抑制剂AMPT可降低应激大鼠杏仁核BLA神经细胞caspase12、caspsae3的表达,减轻BLA区神经细胞(包括GABA能神经细胞)的损伤。第三部分内质网应激PERK通路参与应激大鼠杏仁核基底外侧核神经细胞损伤的机制研究目的:探讨杏仁核BLA区神经细胞(包括GABA能神经细胞)内质网应激PERK通路中GRP78、p-PERK、CHOP、caspase12、caspase3蛋白表达动态变化以及与神经细胞损伤的相关关系;使用PERK通路相关抑制剂salubrinal,对比观察应激大鼠行为学、神经内分泌变化以及杏仁核BLA区神经细胞(包括GABA能神经细胞)的病理学改变,明确内质网应激PERK通路在杏仁核BLA区神经细胞(包括GABA能神经细胞)损伤中作用机制。方法1造模前给予腹腔注射salubrinal,采用束缚加冰水游泳建立应激大鼠模型。通过自发活动和高架十字迷宫观察应激大鼠行为学改变。2酶联免疫吸附实验检测大鼠杏仁核ATP的含量;采用液相色谱-质谱联用法检测GABA和GLU及其衍生物的含量。3通过HE染色、硫堇染色和Fluoro-Jade B荧光染色观察大鼠杏仁核BLA区神经细胞的病理学改变。4免疫组织化学实验观察杏仁核BLA区神经细胞内质网应激蛋白GRP78、p-PERK、CHOP和caspase12、caspase3的表达变化。采用GABA能神经细胞特异性标记蛋白GAD65/67,观察杏仁核BLA区GABA能神经细胞数量变化。5 Western blot检测杏仁核内质网应激蛋白GRP78、p-PERK、CHOP和caspase12、caspase3的表达变化。6免疫荧光多重标记观察杏仁核BLA区GABA能神经细胞GAD65/67与GRP78、p-PERK、CHOP、caspase12、caspase3的共表达阳性细胞数量。结果1.通过自发活动及高架十字迷宫观察到stress+SAL组与stress组大鼠相比焦虑样行为程度有所减轻(P<0.05),但与对照组和溶剂组相比仍有明显的焦虑样行为改变(P<0.05)。2.Stress+SAL组杏仁核ATP含量明显高于stress组大鼠(P<0.05),但与对照组和溶剂组相比仍降低(P<0.05)。3.Stress+SAL组杏仁核GLU含量低于stress组(P<0.01);GABA含量高于stress组(P<0.01),改善GLU/GABA比值。4.HE染色结果表明stress+SAL组BLA区神经细胞固缩现象与stress组相比明显减少。5.硫堇染色结果表明stress+SAL组杏仁核BLA区神经细胞变性现象较stress组相比有所减轻。6.Fluoro-Jade B染色结果表明stress+SAL组杏仁核BLA区神经细胞变性死亡数量较stress组相比减少(P<0.01);但与对照组和溶剂组相比仍有增多(P<0.01)。7.免疫组织化学染色结果显示杏仁核BLA区神经细胞中内质网应激蛋白GRP78、p-PERK、CHOP呈现先明显升后略下降的趋势,与对照组相比均明显升高(P<0.05)。caspase12、caspsae3则表现为持续增加的趋势,与对照组相比均明显升高(P<0.05)。Stress+SAL组杏仁核BLA区神经细胞CHOP、caspase12和caspsae3的表达量较应激组均显著降低(P<0.01);表明salubrinal可改善杏仁核BLA区神经细胞的损伤。8.Western blot检测蛋白半定量结果显示,大鼠杏仁核中内质网应激蛋白GRP78、p-PERK、CHOP呈现先增加后略降低的趋势,与对照组相比均明显升高(P<0.05);caspase12、caspsae3表现为持续增加的趋势,对照组相比均明显升高(P<0.05)。Stress+SAL组杏仁核CHOP、caspase12和caspsae3表达量较应激组相比均明显下降(P<0.05)。9.免疫荧光多重标记(激光共聚焦)显微镜观察:随着应激时间的延长,GRP78、p-PERK、CHOP及caspase12、caspsae3与GAD65/67共表达的阳性细胞数量均呈现了先增加后略降低的趋势,但较对照组均明显升高(P<0.01)。Stress+SAL组CHOP、caspase3蛋白GAD65/67共表达的阳性细胞数量较应激组明显减少(P<0.01);caspsae12与GAD65/67共表达的阳性细胞数量较应激组有所减少(P<0.05);但均较对照组仍明显增加(P<0.01)。表明salubrinal可有效降低应激大鼠杏仁核BLA区GABA能神经细胞的损伤。10.GAD65/67免疫组织化学染色结果显示:stress+SAL组杏仁核BLA区GABA能神经细胞数量和应激组相比有所升高(P<0.05)。表明salubrinal可有效改善应激大鼠杏仁核BLA区GABA能神经细胞的生存状况。小结1.内质网应激PERK通路参与了杏仁核BLA区神经细胞的变性死亡。2.Salubrinal抑制剂可以减轻BLA区神经细胞(包括GABA能神经细胞)的损伤状况,改善杏仁核E/I比值,缓解应激大鼠焦虑状态。结论本研究以束缚应激加冰水游泳大鼠应激模型为主要研究对象,结合在体使用酪氨酸羟化酶抑制剂AMPT和内质网应激PERK通路相关抑制剂salubrinal,观察在不同条件作用下应激大鼠精神行为学、神经内分泌以及杏仁核基底外侧核神经细胞(包括GABA能神经细胞)相关蛋白表达变化,得出以下结论:1.束缚加冰水游泳应激可导致杏仁核基底外侧核神经细胞(包括GABA能神经细胞)变性死亡和E/I失衡,出现焦虑样行为改变。2.儿茶酚胺介导应激大鼠杏仁核基底外侧核神经细胞(包括GABA能神经细胞)变性死亡。3.内质网应激PERK通路参与应激大鼠杏仁核基底外侧核神经细胞(包括GABA能神经细胞)变性死亡过程。综上,束缚加冰水游泳应激大鼠在儿茶酚胺的介导下,持续激活杏仁核,造成杏仁核E/I失衡、ATP含量下降,诱发内质网应激过度表达,经PERK通路导致杏仁核基底外侧核神经细胞(包括GABA能神经细胞)变性死亡。