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人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor,hGM-CSF)是由127个氨基酸组成的造血生长因子。hGM-CSF主要生物学功能是刺激造血前体细胞的增殖、分化和增强成熟效应细胞（主要是中性粒细胞、嗜酸性细胞和单核/巨嗜细胞）。在临床上主要用于骨髓移植、癌症、AIDS、白细胞减少等病症的辅助治疗。但在治疗中还存在许多未尽人意之处，如比活性低，治疗时用量大，循环半衰期短等缺点。临床实验表明，酵母系统表达的hGM-CSF与大肠杆菌体系表达的hGM-CSF相比，具有较小的毒性和副反应发生率。天然hGM-CSF由于糖基化程度不同，分子量从14.5-32KD不等。根据相关文献报道，临床试验表明未糖基化的hGM-CSF的生物活性更高。由此，我们实验室利用引物导入点突变的方法，从人胎肝cDNA文库中钓出该基因并突变了其中的两个糖基化位点,即把9-Ser10-Thr变为9-Ala10-Ala。经限制性酶切鉴定和DNA序列分析证明，获得与设计一致的突变型hGM-CSF基因片段。将该基因片段克隆至酵母中间质粒载体pPIC9K质粒上，通过转化大肠杆菌TOP10F’，扩增重组质粒，将带hGM-CSF基因的重组质粒线性化后，导入甲醇酵母(Pichia Pastoris)宿主系统，与酵母染色体同源重组，只有重组酵母菌株能利用His4-培养基，由此特性排除非重组菌株。利用毕赤酵母抗G418的特性，梯度筛选得到多拷贝高表达的工程菌。并对工程菌表达条件的优化做了一些初步的探索。本实验以野生型hGM-CSF基因在毕赤酵母中表达作对照。甲醇酵母(Pichia Pastoris)是一种新型外源基因表达系统，易于操作，具有真核生物的特性，有许多优点：含有诱导型启动子，用甲醇可以严格地调控表达；外源基因多拷贝重复整合到酵母染色体上，表达稳定；可以胞外分泌表达，外源蛋白可以直接分泌到培养基中，有利于维持其天然构型、生物活性及下游的分离纯化；生存能力强，培养基成本较低廉，发酵工艺成熟，生物量大，易于实现高密度、高表达及大规模培养，甚至放大至工业化规模进行生产。本实验中，我们成功地将hGM-CSF基因导入毕赤酵母中高效表达。我们尝试对其潜在的O-糖基化位点9-Ser、10-Thr作了突变，该突变型基因表达的产物分子量约为14.7KD，Western Blot显示具有天然分子的免疫原性和生物活性，其表达量为100mg/L左右。这个结果还将有助于对毕赤酵母在表达后修饰及其糖基化问题作进一步研究。