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沙门氏菌是重要的肠道病原菌,根据抗原的不同分为2500个血清型,绝大多数沙门氏菌对人和动物都有致病性,并是人类食物中毒的主要病源之一,严重影响着人和动物的健康。因而,通过探讨沙门氏菌invH基因的免疫功能,对研制新型疫苗防治沙门氏菌病具有重要意义。本研究采用分子生物学技术,首先将沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的invH入侵基因进行了克隆表达,然后制备了重组蛋白疫苗和C3d分子佐剂核酸疫苗,通过细胞转染和动物试验,探索了invH的免疫功能,取得了预期的效果。本研究分三部分内容:一、不同来源沙门氏菌入侵基因invH的检测及序列分析根据沙门氏菌invH基因序列设计一对引物,用聚合酶链反应技术对9株沙门氏菌和4株常见病原菌进行PCR扩增,并将扩增出的invH基因进行克隆及序列分析,应用生物信息学方法预测invH蛋白的T细胞抗原表位。结果发现,9株沙门氏菌PCR均扩增出519bp的特异条带,4株非沙门氏菌均无特异带扩增;核苷酸序列分析证实,9株菌中3株鼠伤寒沙门氏菌之间同源性为99.8%,与鸡白痢和鸡肠炎沙门氏菌之间的核苷酸序列同源性为98.6%;3株猪伤寒沙门氏菌和3株鸡源性沙门氏菌同源性低,且不在同一条系统进化树上;invH蛋白有5个重复率最高的T淋巴细胞受体识别的抗原表位。该研究建立的沙门氏菌的PCR检测方法具有很好的特异性和敏感性,不同来源沙门氏菌的invH基因有种属差异性,基因表达蛋白的氨基酸序列决定了其具有刺激免疫系统产生T淋巴细胞介导的免疫反应的分子基础。二、沙门氏菌invH基因的重组表达与免疫功能研究采用PCR技术对鼠伤寒沙门氏菌(DT104株)的入侵基因H进行扩增,将其克隆到原核表达载体PGEX-4T-3中,将重组克隆进行融合蛋白表达、纯化和Western blot检测,用油乳剂佐剂将融合蛋白制备蛋白疫苗,将该疫苗通过三种不同剂量(40μg/只、60μg/只、80μg/只)免疫注射小鼠进行免疫保护效果测定,采用黏附与黏附抑制试验对抗血清的活性进行分析。结果表明,构建的重组克隆成功表达了44KD的融合蛋白GST-invH,且该蛋白具有良好的免疫原性;三种剂量蛋白疫苗间的免疫效果差异不显著,均能提高小鼠体内IL-4和IFN-γ的含量,与对照组比较差异显著(p<0.05);灭活疫苗组保护率为90%,三种剂量重组蛋白疫苗组的保护率均在60%以上,虽然重组蛋白疫苗的保护效果不及灭活疫苗,但与对照组相比差异均极显著(p<0.01);体外黏附抑制试验结果发现,抗融合蛋白GST-invH的抗体能抑制沙门氏菌对靶细胞的黏附。该研究结果为沙门氏菌病的有效防制提供了科学依据。三、C3d-P28分子佐剂沙门氏菌invH核酸疫苗的构建及免疫效果研究分别克隆小鼠的C3d-P28基因和沙门氏菌的invH基因,构建pcDNA3.1-invH和pcDNA3.1-invH-P28.6(含invH基因和6个拷贝的C3d-P28编码的基因)重组质粒;提取重组质粒转染Marc-145细胞、IFA检测蛋白表达,将小鼠随机分成5组,空白对照组(I)、灭活疫苗组(II)、空质粒组(III)、pcDNA3.1-invH组(IV)和pcDNA3.1-invH-P28.6(V),核酸疫苗组采用肌肉注射,100μg/100μL·只,注射3次,每次间隔2周。用ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。第7周,用鼠伤寒沙门氏菌DT104株攻毒,100LD50/只,计算保护率、抗血清体外活性分析。结果表明,成功构建了沙门氏菌的核酸疫苗(pcDNA3.1-invH、pcDNA3.1-invH-P28.6),并能在Marc-145细胞内表达。V组的抗体水平和IL-4、IFN-γ的含量虽然不如II组的高,但是明显高于IV组且差异显著(P<0.05),与I组和III组相比差异极显著(P<0.01),并且能够提供60%的保护率。体外黏附抑制试验结果发现,抗融合蛋白invH的抗体能抑制沙门氏菌对靶细胞的黏附。该研究结果表明,invH基因疫苗具有很好的免疫效果,C3d-P28是一种安全有效的分子佐剂。