B19病毒属细小病毒属，是动物病毒中结构最简单的一种单链、线状DNA病毒，于1975年被发现，随后被证实是已知的细小病毒属中唯一致人类疾病的病毒，可引起传染性红斑、关节炎、粒细胞减少症等，甚至引起严重的血液系统疾病。其主要经呼吸道、血液途径和母婴垂直传播，可引起社区局部流行、院内感染和暴发性流行，并在全球普遍存在。1990年首次证实我国存在该病毒感染，随后的研究发现该病毒是我国儿童急性再障危象、急性血小板减少性紫癜及孕妇非免疫性流产等疾病的重要病因之一，并与先天性心脏病、类风湿关节炎(RA)发病相关。同时，我国妇女和儿童血清中保护性抗体水平低，易发生该病毒感染。尤其免疫功能低下或缺陷患者可发生持续感染、重症血液病和慢性贫血，危及生命。 B19病毒基因约5.6kb，由一个内含子和位于两端的重复序列组成。在B19病毒基因组内有两个大的开放读框，编码非结构蛋白(NS)和两个衣壳蛋白(VP1和VP2)。B19病毒序列存在变异。NS基因最为保守，在病毒的复制中起重要的作用，VP1和VP2表现出较大的变异性，约为2～3％。根据酶切图谱的不同，将病毒分为4型。中国西安的 第四军医大学博士学位论文3株B19病毒(XA株)与其它国家的病毒株相比，在核昔酸水平和氨基酸水平上均有着显著的差异。 VPI和VPZ蛋白组成衣壳包裹在B 19病毒DNA表面，构成B19病毒的抗原性。病毒的主要中和抗原表位位于VPI独特区和VPI一VPZ连接区，v尸1独特区是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。非结构蛋白NS和B19病毒毒力有关。VPI和VPZ蛋白，特别是VPI独特区，对B19病毒的诊断和保护性疫苗的制备非常有意义。 但是，由于B19病毒不能在传统的培养基上生长繁殖，抗原来源十分困难，加之XA株B19病毒VPI独特区在核昔酸水平和氨基酸水平上与标准株相比存在着显著的差异，需要大量制备中国株B19病毒VPI蛋白作为抗原，为制备特异性诊断试剂和疫苗创造条件。 研究目的:本项实验主要是构建XA株B19病毒VPI基因原核表达载体，大量表达VPI蛋白，进一步对、甲1蛋白进行纯化，并以聚丙烯酞胺为佐剂免疫动物，检测VPI蛋白的免疫原性，制备具有一定敏感性和特异性的抗VPI蛋白多克隆抗血清，为进一步B19病毒XA株的检测和疫苗的制备准备条件;同时构建B19病毒VPI基因真核表达载体，为进一步研究VPI蛋白的生物学功能，探讨B19病毒的致病机制奠定基础。 实验方法:1.利用酶切、回收等分子生物学方法，从我所已构建的pUC19一vPI质粒中，获得我国B19病毒流行株(XA株)的vPI基因。将所获得的片段克隆至原核表达载体pQE 30的相应位点中，通过酶切进行鉴定。为了选择高效稳定表达vPI蛋白的载体，对己构建的vPI一pQE 30质粒以不同的酶进行酶切，并利用回收、连接、酶切等分子生物学方法，构建并鉴定另一个原核表达载体VPI一pRSET 第四军医大学博士学位论文A。两种重组体VPI一pQE 30和VP一pRSETA的阳性克隆均进行了测序分析。 2.分别诱导含有构建成功的两种重组体的菌株表达vPI融合蛋白，利用SDS一PAGE分析蛋白表达情况，利用Western Blot鉴定表达的融合蛋白。 3.在不同的温度、诱导剂浓度、诱导时间下，分别诱导含有两种重组体的菌株表达VPI融合蛋白，比较不同条件下VPI融合蛋白的表达率，并对两种质粒的表达率进行比较，选择最佳的表达条件，同时对诱导后的细菌进行裂解，通过SDS~PAGE分析裂解上清和沉淀中蛋白组成和含量，了解融合蛋白的表达形式。 4.大量诱导表达VPI融合蛋白，洗涤和纯化主要由VPI融合蛋白构成的包涵体，通过SDS一PAGE进一步纯化VPI蛋白，将含有VPI蛋白的聚丙烯酞胺凝胶制备成为抗原。 5.利用上述抗原免疫兔，获得抗VPI的多克隆抗血清。应用ELISA法鉴定该抗血清的效价，Western B10t法鉴定其特异性。 6.构建VPI基因的真核表达载体VP卜pEGFP一CI，利用脂质体介导的基因导入法将重组体VPI~pEGFP一Cl和空载体pEGFP一CI导入人宫颈癌Hela细胞，经G418筛选获得稳定转染的细胞系;利用荧光显微镜、免疫细胞化学和Western B10t法观察细胞转染后VPI蛋白的表达情况。 实验结果:l.vPI一pQE 30质粒经BamHI和Sall，vPI一pRSETA质粒经BamHI和pstl双酶切，均可切出分子量约480bp的片段，与预期结果相符。两种重组体测序结果证实序列完全正确。 2.分别含有两种重组体的菌株经诱导剂工PTG诱导，均可表达分子量约为22KD的蛋白，经western Blot鉴定， 第四军医大学博士学位论文均可与6一His抗体结合，为VPI融合蛋白。 3.对诱导表达条件分析发现:①vPI一pQE 30在37℃下无表达，25℃下有表达，表达率为16%，vPI一pRSETA在37℃下表达率(17.8%)最高，30℃下有表达，25℃下几乎无表达;②vPI一pQE 30在诱导剂浓度为0.05一lmm。1/L时均有表达，表达率相近，为’(16土1)%，VPI一pRSETA在诱导剂浓度为0.5mm01/L时表达率最高，为19.6%;③vPI一pRSETA在诱导表达5小时