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兔瘟是对养兔业造成最大危害的一种重要病毒性传染病,具有高度接触性致死性。其病原体是兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV),属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。杯状病毒科病毒具有较广的宿主范围,能引起多种动物和人类疾病。杯状病毒侵入宿主细胞是病毒进行感染的首要环节,杯状病毒首先需要与受体结合,之后通过细胞内吞作用进入细胞。关于杯状病毒的细胞受体,目前只在少数几个种属中获得了一定的进展,但关于RHDV的细胞受体仍是一片空白。为了筛选和鉴定RHDV的细胞受体,我们利用杆状病毒表达系统表达了RHDV的衣壳蛋白(VP60),纯化获得了病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)以及利用SMART方法构建了RHDV的宿主细胞-RK13细胞的cDNA真核表达文库。
1.RHDV JX/97分离株VLPs的制备
以实验室保存的JX/97分离株全长cDNA分子克隆质粒pBIRHDV为模板,设计并合成了覆盖JX/97分离株基因组中vp60的含酶切位点的引物对,通过PCR扩增获得vp60基因,将基因片段双酶切后分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacl上。重组质粒转化DH10Bac后发生转座,通过“三抗”板和蓝白斑法筛选到阳性克隆后,提取重组Bacmid DNA,转染Sf9细胞,6天后收集上清,用上清重新感染新的Sf9细胞,依次感染细胞2次。待Sf9细胞发生明显病变时,收集上清即为重组杆状病毒,取部分用于检测或扩大培养。间接免疫荧光和Western Blot检测结果表明重组蛋白在Sf9细胞中正确表达,进一步的电镜观察显示重组病毒感染的Sf9细胞内以及纯化的重组蛋白都能自我组装形成VLPs。
2.RHDV JX/97分离株宿主细胞RK13 cDNA真核表达文库的构建
以兔肾细胞系RK13为材料提取细胞总RNA,然后用链霉亲和素磁珠(SA-PMP)分离纯化获得mRNA。利用SMART技术,即以SMART IV Oligonucleotid作为接头,在3ˊ末端加上一段序列,再利用CDSⅢ/3ˊPCR Primer尽量将mRNA全部反转录成cDNA,从而获得了全长cDNA的第1链,用LD-PCR方法扩增双链cDNA。经SfiⅠ酶切后过柱分级收集ds cDNA,选取大片段ds cDNA(>500 bp),核酸沉淀后克隆到SfiⅠ酶切的真核表达载体pEXP-Lib中。最后,利用电转仪1.8 KV200 Q25μF,电转化至宿主菌电转感受态细胞(DH5α)获得了cDNA文库,通过计算文库的库容量达到2.55×105CFU,随机挑取16个克隆,用合成的载体上的测序引物PCR扩增,发现插入的cDNA片段大小在400-2250 bp之间,插入片段的平均长度约1.0 Kb。以上结果表明,利用RHDV宿主细胞RK13为材料,构建了一个较高质量的全长cDNA真核表达文库,库容量达2.55×105CFU,可以满足后续工作的需要。
表达获得的RHDV空衣壳蛋白及其宿主细胞RK13全长cDNA真核表达文库的构建,为进一步利用空衣壳蛋白代替RHDV粒子,通过蛋白互作从全长cDNA真核表达库中筛选出受体蛋白奠定基础。