顺铂是临床上广泛应用的抗癌药物。铜外排蛋白ATPases的Cu(I)结合域(MBDs)与顺铂相互作用,参与肿瘤细胞的耐药。虽然所有的MBDs具有高序列同源性和相似的蛋白质折叠,但不同的MBDs在铂的转运过程中具有不同的功能。四硫代钼酸盐(TM)是临床上用于治疗威尔逊疾病的药物。TM和ATP7B与抗癌药物顺铂的功能有关。TM可以提高药物疗效,降低顺铂的耐药性,而ATP7B参与顺铂的耐药性,但这些药物之间的分子机制和相关性尚不清楚。为了研究ATPases对顺铂抗癌作用的影响,以及通过小分子药物克服细胞耐药性,提高细胞对顺铂药物的敏感性,我们选择ATP7A/7B的N端金属结合域作为研究对象,探索蛋白与顺铂药物的相互作用,以及四硫代钼酸铵对顺铂作用于蛋白的影响。具体研究内容包括以下几方面:第一部分系统研究ATPase的N端九个MBDs与顺铂的相互作用,比较金属结合域蛋白与顺铂的反应活性,并研究了铜存在时对蛋白与顺铂反应的影响。通过荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、离子交换等手段得到九个金属结合域蛋白与顺铂反应的活性高低。顺铂与铜结合区域的半胱氨酸结合,且铜的存在对蛋白铂化起到促进作用,但促进程度相差很大。此外,铂结合并不会导致铜离子从MBDs中解离出来,只会减弱Cu(I)与MBDs的相互作用,因此,铜染料BCA可以从铂化Cu-MBDs中竞争结合铜,但不能从天然Cu-MBDs中得到铜。第二部分研究了 TM与ATP7B(WLN4)金属结合域的反应,探索TM对WLN4铂化的影响,以及TM桥联的两个金属结合域。X-射线晶体衍射分析发现,WLN4与TM反应后形成以Mo2S6O2为中心的蛋白二聚体,且钼原子直接与WLN4的疏基结合。Mo配位可导致铜离子从Cu-WLN4释放,形成不含铜的蛋白二聚体。由于铜配位氨基酸也是ATP7B的顺铂结合位点,因而Mo原子的配位抑制铂与蛋白的结合。将ATP7B多金属结合域的保守氨基酸序列CxxC突变为SxxS,质谱、SEC-MALS、紫外检测可知TM可以通过分子内交联将ATPase中的两个MBDs交联起来,有效抑制蛋白与顺铂的反应,从结构方面解释了TM降低蛋白对铂药物隔离,提高顺铂治疗效果的机理。第三部分主要研究ATPases的N端金属结合域与顺铂和Pt/Atox1相互作用。比较顺铂导致MBDs铂化的效率与Pt/Atox1导致MBDs铂化的效率,由荧光结果可知顺铂导致WLN1、WLN4、MNK5、MNK6蛋白铂化的效率与Pt/Atox1导致蛋白铂化效率一致;MNK3、MNK4、WLN2从Pt/Atox1获得铂的效率大于直接与顺铂反应效率。由此可见不同的MBDs接受Pt/Atox1传递Pt的能力不同,通过离子交换色谱实验也验证了Pt从Atox1向ATPase的转移。DNA是顺铂的作用靶点,通过研究细胞质中ATPase对铂药物分布、传递的影响,有助于理解铂耐药产生的机理。通过研究小分子四硫代钼酸铵对蛋白铂化的影响,解释了四硫代钼酸铵和顺铂在肿瘤化疗中的协同作用,为提高肿瘤化疗效果提供了理论基础。