CD133核酸适配体的筛选

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shirley09liu
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背景:肿瘤是一种严重威胁着人类健康的恶性疾病,尽管近年来肿瘤的诊断和治疗水平都有很大提高,肿瘤复发和转移仍然是肿瘤病人的主要死亡原因。肿瘤干细胞是一群具有自我更新、多向分化潜能,具有启动和重建肿瘤组织表型能力的肿瘤细胞。它们是肿瘤发生、发展、转移、复发和对抗放、化疗的根源。因此,针对肿瘤干细胞进行肿瘤早期的靶向诊断和治疗,为肿瘤的诊治带来新的方向,也成为肿瘤相关研究发展的必然趋势。CD133是细胞表面一个五次跨膜的糖蛋白,在多种实体肿瘤干细胞中均有表达,被公认为肿瘤干细胞标记物。核酸适配体(aptamer)是利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),从人工合成的随机单链DNA(ss DNA)或RNA文库中筛选得到的,能够高亲和力、高特异性地结合靶标的一段DNA或者RNA序列。它的作用类似于抗体,且具有靶分子范围广泛、分子量小、易于合成、免疫原性低、特异性强等优点,是抗肿瘤研究中一种理想的靶向工具。近年来,随着许多肿瘤相关核酸适配体的发现,核酸适配体在生物医学、疾病诊疗领域显示出广阔的应用前景,然而这些肿瘤相关的核酸适配体大多仅能识别一种肿瘤细胞或单一的肿瘤微环境,未能靶向肿瘤的源头。因而,若能筛选出特异性靶向肿瘤干细胞的适配体,可为肿瘤的诊治提供更好的靶向工具。CRISPR/Cas9技术源于细菌中的免疫系统,利用RNA识别并指导Cas9蛋白对靶向基因进行编辑,我们运用CRISPR/Cas9技术构建出稳定高表达CD133蛋白的细胞系,既解决了靶标细胞获取困难的问题,也有效避免体外人工合成蛋白与细胞膜蛋白天然构像的差异,再利用Cell-SELEX技术筛选特异性识别人CD133蛋白的核酸适配体。目的:结合CRISPR/Cas9技术,运用Cell-SELEX技术筛选出能特异性识别人CD133蛋白的核酸适配体序列,为从肿瘤源头上的靶向诊疗,提供一种具有潜在临床应用价值的靶向工具。方法:应用CRISPR/Cas9基因编辑技术将人CD133基因(CAG-Pr-CL-ZK-003-PA-Lox P-Puro R-Lox P)插入到h AAVS1位点,建立高表达人CD133蛋白的CD133+293T细胞系,将其作为靶细胞,使用293T细胞系作为对照细胞。以Cell-SELEX方法为基础,人工合成长度为88个碱基(内含52个随机碱基)的随机寡核苷酸序列文库进行筛选,筛选过程中逐渐调整筛选压力以提高筛选效率。在筛选文库富集程度达到饱和时,对富集文库进行TA克隆并测序。通过将克隆测序结果进行一级结构的比对分析和二级结构的考察,选择重复性高的代表性DNA序列进行带有FITC荧光标记的合成即为候选适配体。通过流式细胞仪检测具有荧光标记的候选适配体序列,考察其性质;对性能良好的候选适配体进行序列截短修饰,进一步考察其特异性和亲和力。选择出最佳结合能力的截短序列,再次使用流式检测其结合CD133+肿瘤细胞的能力。结果:1.CD133+293T细胞高表达人CD133蛋白。2.经过14轮筛选,获得4条能特异性结合于靶细胞CD133+293T的核酸适配体,分别命名为C-Apt1,C-Apt2,C-Apt3和C-Apt4。3.经流式细胞术检测,这四条适配体平衡解离常数(Kd值)均处于纳摩尔级别,具有较高的亲和力,其中C-Apt2的Kd值为12.47±4.32 n M。4.对四条适配体进行生物学特性的鉴定,各条适配体在4°C与37°C环境中均能与靶细胞CD133+293T结合,证实了筛选的适配体在体内外环境中均可发挥较好的生物学效应,而基本不受到环境温度的影响。5.将具有最强亲和力的适配体C-Apt2进行部分截短的序列优化,合成三条截短序列C-Apt2a、C-Apt2b及C-Apt2c。其中C-Apt2b长度为70 bp,且与C-Apt2具有相仿的结合能力。流式结果也证实,该适配体对CD133+肿瘤细胞具有良好的结合性。结论:本研究成功筛选出能与肿瘤干细胞表面分子CD133高亲和力、高特异性结合的核酸适配体,为靶向肿瘤干细胞的肿瘤诊断与治疗提供了一种具有潜在临床应用价值的靶向工具。
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