金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)属于革兰氏阳性菌,不但能够引起皮肤和软组织感染,严重者可引起威胁生命的菌血症、肺炎、骨髓炎、脑膜炎及脓毒血症。自1961年Jevons等发现世界上第1例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aures,MRS A)以来,新的耐药株不断出现并在世界范围内造成感染的流行,而近年来抗生素的滥用导致细菌耐药程度进一步加重,因此,免疫学防治手段被寄予希望。现阶段针对金葡菌不同成分如细菌表面蛋白、荚膜多糖交联蛋白成分或毒素等致病因子的10余种疫苗尚无一被批准用于临床。S. aureus疫苗研发的难点主要有：①致病因子众多,不同致病因子在感染不同时期表达,单一成分的疫苗效果不佳；②金葡菌可逃避免疫系统对其杀伤；③单纯诱导体液免疫应答的疫苗只能降低动物模型感染的严重程度,而无法阻止二次感染,而最新的研究显示CD4+T细胞尤其是Thl/Th17的激活是清除金葡菌的关键点,提示有效激活T淋巴细胞可作为金葡菌疫苗研发的新思路之一。肽聚糖(Peptidoglvcan,PGN)是金葡菌细胞壁重要的保守成分,不仅能够维持细菌的基本结构和形状,还能保持胞内稳定的渗透压,被喻为细菌的“阿喀琉斯之踵”,意为强者的致命弱点,而另一保守结构LTA,在细菌自身细胞的分裂、维持细胞膜的完整性中发挥重要作用。二者均是G+菌包括金葡菌在内的保守性成分。但PGN和LTA均属于TI抗原(胸腺非依赖抗原),免疫原性弱,不能引起有效再次免疫应答,因此限制其成为疫苗候选。近二十年来,人们关注到感染因子及肿瘤细胞表面多糖和病原体荚膜多糖等TI抗原在其致病中作用,合成肽可以模拟糖类和脂类表位。模拟肽作为糖类或脂类替代物免疫动物后可诱导针对这些TI抗原免疫应答和免疫记忆。然而线性肽分子量小,免疫原性弱,需要选择合适载体交联以有效暴露短肽。多价抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP)与线性肽相比优势在于：分子量大、不需交联载体,可抵抗酶降解,在设计中可选择性加入T表位或B表位以有效诱导不同类型的免疫应答。本课题组在前期工作中利用噬菌体展示肽库技术,筛选出能模拟PGN表位序列的阳性序列,根据其中一条序列(ATWxHxLxSAGL)合成四分枝多价抗原肽MAP-P31,以此MAP作为免疫原诱导小鼠产生针对S.aureus抗体,并对S.aureus致死性攻击具有保护性作用,这提示PGN模拟肽可将其TI(胸腺非依赖性抗原)抗原性质转变为TD(胸腺依赖抗原)抗原性质,并有效诱导有再次抗体应答。然而MAP-P31并不能激活T细胞增殖。在此基础上本研究选择另一条包含保守序列、抗原指数高于MAP-P31的序列SPHxHSRLRSES,合成线性肽SP27 (Biotin-SASPHxHSRLRSESGG)及四分枝多价抗原肽(命名为MAP27),在鉴定线性肽SP27和MAP27抗原性基础上；探讨以MAP27作为免疫原诱导保护性作用及其机制。此外,我们还进行LTA模拟肽初步筛选,获得两条模拟LTA的保守序列VxxDFRQxxQPS和GxxDFRQxxQPS,为后续研究奠定了基础。本项工作包括以下两个部分：第一部分金黄色葡萄球菌非蛋白成分PGN模拟肽保护性作用机制研究一、PGN模拟肽合成与体外鉴定1.线性肽SP27特异性结合抗PGN单抗根据前期工作,选择含保守序列“xH”的No.27号阳性噬菌体克隆(SPHxHSRLRSES)合成线性肽SP27(Biotin-SASPHxHSRLRSESGG)和SP27b(Biotin-SPHxHSRLRSESSAGG),SA、 GG.SAGG为两侧发挥支架作用的氨基酸残基,ELISA结果显示：SP27和SP27b均呈剂量依赖性特异性结合抗PGN单抗,且不与抗LTA单抗反应,提示核心序列SPHxHSRLRSES模拟PGN表位。2.四分枝多价抗原肽MAP27特异结合抗PGN单抗及抗S.aure us多抗基于SP27序列,以多聚赖氨酸为支架合成四分枝多价抗原肽MAP27,ELISA结果显示：MAP27不仅能够特异性结合抗PGN单抗(MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.02;MAP27 vs PBS,P=0.021)也能特异性结合抗金葡菌多克隆抗体(MAP27vs MAP(ctrl),P=0.002；MAP27 vs PBS,P=0.002), 提示MAP27维持原始线性肽SP27抗原性,模拟PGN抗原表位。3.MAP27模拟PGN表位刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌促炎性细胞因子100μg/ml MAP27体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞6h,收取上清,ELISA结果显示MAP27可刺激腹腔巨噬细胞分泌IL-6(MAP27 vs MAP(ctr1),P=0.045；MAP27 vs blank,P=0.018).IL-1β(MAP27 vs MAP(ctrl),P=0.002;MAP27 vs blank,P=0.000),提示该合成肽在一定程度上模拟了PGN的生物学活性。二、PGN模拟肽MAP27主动免疫保护作用1.免疫方法4-6周,雌性BALB/c小鼠随机分为三组,分别以MAP27和MAP(ctrl)加弗氏佐剂进行免疫,两次免疫间隔2周,共进行5次,第三组小鼠同期饲养但未进行合成肽免疫,作为空白对照。合成肽末次免疫后第七天,以2×107CFU/只灭活菌加强免疫三组小鼠(包括空白组)一次。2.MAP27免疫诱导小鼠体内产生低效价抗金葡菌抗体和抗PGN抗体每次免疫后一周检测血清效价。结果显示：与对照组相比,MAP27免疫组在免疫三次后即产生抗MAP27的IgG类抗体,效价达到1：104,并可维持10周。灭活金葡菌加强免疫后,MAP27免疫组小鼠产生抗金葡菌超声裂解产物(MAP27 vsMAP(ctrl),P=0.000;MAP27 vs blank, P=0.000)及抗PGN (MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.026;MAP27 vs blank, P=0.015)的IgG类抗体,但效价仅在1：200倍。3.在补体存在下,兔抗MAP27抗血清体外杀菌/抑菌作用 以MAP27作为免疫原免疫新西兰兔获得抗血清,实验结果显示,在补体存在下兔抗MAP27抗血清产生对甲氧西林敏感株(MSSA,ATCC25923)较强的杀菌/抑制作用(MAP27免疫血清vs正常兔血清,P=0.000)。4.MAP27免疫诱导小鼠抵御金葡菌系统性感染末次灭活菌加强免疫各组小鼠,5天后以致死剂量5×108CFUMSSA攻击(iv),观察各组死亡率。MAP27免疫组小鼠7天内生存率为50%,空白对照组和MAP(ctrl)组小鼠分别在感染后第2天和第5天全部死亡(MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.000;MAP27 vs blank, P=0.000);尾静脉注射亚致死剂量2×107 CFU MSSA (ATCC25923),感染3天后取各组小鼠肾脏、肺脏,研磨后检测脏器中细菌残存量,结果显示MAP27免疫组小鼠肾脏、肺脏中细菌载量显著低于对照组(MAP27 vs MAP(ctrl), Pkidney =0.029, MAP27 vs blank, Pkidney=0.029; MAP27 vs MAP(ctrl), Plung=0.016, MAP27 vs blank,Plung=0.008)。提示MAP27免疫诱导小鼠抵御金葡菌系统性感染。三、PGN模拟肽MAP27诱导保护性作用机制的研究1.MAP27免疫组小鼠在感染早期脏器中IFN-γ、IL-17A/F和CCL3含量显著增高末次以灭活金葡菌加强免疫各组小鼠,尾静脉感染3天后取各组小鼠脏器,研磨后进行细胞因子检测,ELISA结果显示：与MAP(ctrl)组和空白对照组相比,MAP27免疫鼠脾脏、肺脏、肝脏IFN-y (MAP27 vs MAP(ctrl), Pspleen=0.001, MAP27 vs blank, Pspleen=0.000; MAP27 vs MAP(ctrl),Plung=0.000, MAP27 vs blank, Plung=0.000; MAP27 vs MAP(ctrl), Pliver=0.000, MAP27 vs blank, Pliver=0.000)和IL-17A/F (MAP27 vs MAP(ctrl), Pspleen=0.01, MAP27 vs blank, Pspleen=0.014;MAP27 vs MAP(ctrl), Plung=0.000, MAP27 vs blank, Plung=0.000;MAP27 vs MAP(ctrl), Pliver=0.000, MAP27 vs blank, Pliver=0.000)水平明显升高；同时可有效激活巨噬细胞及中性粒细胞的趋化因子CCL3含量也明显增多(MAP27 vs MAP(ctrl), Pspleen=0.022, MAP27 vs blank, Pspleen=0.000; MAP27 vs MAP(ctrl),Plung=0.033; MAP27 vs blank, Plung=0.016; MAP27 vs MAP(ctrl), Pliver=0.017, MAP27 vs blank, Pliver=0.014),提示MAP27免疫可能通过激活T细胞免疫应答发挥保护作用。2.MAP27免疫组小鼠在感染早期脾脏中IFN-γ+CD3+T细胞和IL-17+CD4+T细胞比例增高金葡菌感染3天后流式检测各免疫鼠脾脏胞内IFN-γ、IL-17A表达,结果显示与MAP(ctrl)免疫组和空白对照组相比,MAP27免疫组IFNy+CD3+T细胞比例(MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.021;MAP27 vs blank,P=0.03)以及 IL-17A+CD4+T细胞比例明显升高(MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.021;MAP27 vs blank, P=0.012),提示感染早期诱导MAP27免疫鼠体内T细胞免疫应答。3.体外实验表明,MAP27刺激免疫鼠脾细胞分泌Thl型细胞因子末次灭活菌加强免疫一次后第5天,分别取各组小鼠脾细胞,体外培养中以100ng/mlMAP27刺激各免疫组小鼠脾细胞24h,ELISA检测上清中细胞因子含量。结果表明MAP27免疫鼠脾细胞上清中IL-2、IFN-γ含量显著高于对照肽免疫组及空白对照组小鼠(IL-2:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.000, MAP27 vs blank, P=0.000; IFN-y:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.000, MAP27 vs blank, P=0.000),而IL-4含量各组别间均无差异(P>0.05)；未检测到IL-17A/F。ELISPOT结果显示低剂量MAP27及抗小鼠CD28抗体刺激MA27免疫鼠生成IFN-y斑点形成细胞(spot-forming cells, SFCs)显著多于MAP(ctrl)免疫组和空白组(MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.001;MAP27 vs blank,P=0.001),提示合成肽体外刺激可能诱导免疫鼠脾细胞产生相应的Thl型细胞免疫应答。4.体外实验表明,灭活菌刺激MAP27免疫鼠脾细胞分泌Thl和Th17细胞因子天然抗原灭活菌体外刺激各免疫鼠脾细胞72h, ELISA结果示MAP27免疫鼠脾细胞上清中IL-2/IFN-γ和IL-17A/F含量显著高于对照肽免疫组和空白对照组(IL-2:MAP27 vs MAP (ctrl),P=0.041, MAP27 vs blank,P=0.024;IFN-y:MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.028, MAP27 vs blank, P=0.032; IL-17A/F: MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.039, MAP27 vs blank, P=0.043),而IL-4含量各组别间均无差异(P>0.05)。ELISPOT结果示灭活菌刺激24h IFN--γ和IL-17A/F斑点形成细胞数量显著高于对照肽组和空白对照组(IFN-γ:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.0126, MAP27 vs blank, P=0.0041; IL-17A:MAP27 vs MAP (ctrl), P=0.0034, MAP27 vs blank, P=0.0039),提示MAP27免疫组小鼠脾细胞可识别天然抗原并分泌Th1/Th17型细胞因子。第二部分LTA模拟肽筛选与鉴定一、应用噬菌体展示技术筛选金葡菌LTA模拟肽克隆1.噬菌体肽库筛选以抗LTA单抗为钓饵蛋白,分别采用固相法和液相法对噬菌体12线性肽库进行三轮筛选。固相法筛选富集率仅44倍,而液相筛选富集率可达300倍。从固相法所得第三轮洗脱产物中随机挑选65个噬菌体克隆,双夹心ELISA鉴定后得到18个与抗LTA单抗结合的阳性克隆；从液相法第三轮洗脱产物中随机挑选45个噬菌体克隆,夹心ELISA鉴定后仅得到4个与抗LTA单抗特异性结合的克隆。相较于固相筛选,液相筛选所得阳性克隆无非特异吸板序列。2.阳性噬菌体测序及序列分析将固相法所得18个阳性噬菌体克隆进行测序,对氨基酸序列进行分析,共得到9个不同的序列。其中第3、5、25、41、43、56、65号克隆有共同序列：VHxDFRQxxQPS,第4、21、27、32号克隆有共同序列xHxSxIYSTMNP,并与第8、17、34、36、28号噬菌体共有保守序列Hx或xx,而29、55号噬菌体克隆与上述保守序列均不同。液相法所得的4个阳性噬菌体克隆测序后进行氨基酸序列分析,得到4个完全不同的氨基酸序列,其中2号噬菌体克隆序列为GHxDFRQxxQPS,与固相法所得3号噬菌体克隆序列仅相差一个氨基酸。二、模拟肽的合成及抗原性鉴定选择含保守序列Hx或xx的阳性噬菌体克隆合成线性肽L3-1 (HSVHxDFR QxxQPSGGGS)和L2(HSGHxDFRQxxQPSGGGS),HS、GGGS为起支架作用氨基酸残基,ELISA结果显示L3-1和L2均能以浓度梯度依赖方式和抗LTA单抗结合,且L3-1反应优于L2,故根据L3-1序列合成四分枝多价抗原肽,命名为MAP3,体外ELISA鉴定显示MAP3与抗LTA单抗能较好地结合。上述结果提示线性肽L3-1、L2及四分枝多价抗原肽MAP3模拟LTA的抗原表位,为后续研究提供基础。