在机体的正常生理活动中,肺脏的主要功能是负责机体与外界环境的气体交换。肺脏的这种特殊生理功能决定其成为一个对外开放的器官,这就使得肺脏时刻接受来自外界环境中非己物质以及各种微生物的刺激。然而,令人惊讶的是,尽管呼吸道拥有巨大的表面并且每天有大量的感染因子伴随空气进入呼吸道,但是呼吸道炎症反应却很少发生。人的上呼吸道同肠道一样,有大量共生菌的寄居,宿主与共生菌之间的相互作用往往是互惠互利的。已有研究发现,肠道共生菌在肠道免疫系统的形成以及肠道免疫稳态的维持中都发挥着重要的作用。肠道共生菌的组份能够刺激肠道上皮细胞表达的Toll样受体从而保护肠道上皮组织抵抗有害病原体的感染。呼吸道共生菌是否也具有与肠道共生菌相似的功能,能够保护呼吸道抵抗有害病原体的感染和维持呼吸道免疫系统的稳态呢?这是本论文的研究目的之一。在正常状态下,呼吸道免疫系统受到免疫负向调节机制的严格控制以防止有害炎症反应的发生。然而,当外来病原体在呼吸道中建立有效感染时,呼吸道免疫系统会被快速激活从而对病原体进行清除。然而,过度的免疫应答在清除病原体的同时会导致机体组织发生免疫病理损伤甚至死亡。流行性感冒,简称流感,是一种由流感病毒引起的呼吸道感染疾病,在世界各地经常会有区域性和季节性的大流行。据统计,全世界每年有300到500万人因流感死亡。研究发现,过度免疫应答导致的病理损伤是流感病毒感染导致宿主死亡的重要原因。在临床上,流感除有咳嗽、发热、头疼等主要症状外,还会引发腹痛,恶心,呕吐和腹泻等类似肠胃炎的并发症,在儿童中更甚。尽管在许多流感病人中都发现有这些类似胃肠炎的症状,但其免疫学机制尚不清楚,这是本论文的另一个研究目的。在本论文中,我们取得了两部分的结果：Ⅰ、呼吸道共生菌抑制流感病毒感染诱导的致死炎症；Ⅱ、呼吸道流感病毒感染诱导Th17细胞依赖的小肠免疫损伤。Ⅰ、呼吸道共生菌抑制流感病毒感染诱导的致死炎症在本部分中,采用金黄色葡萄球菌(S. aureus)滴鼻致敏小鼠建立S. aureus上呼吸道共生模型,之后利用该模型探讨了呼吸道共生菌对流感病毒感染的影响。通过给小鼠滴鼻接种流感病毒PR8建立感染模型；利用H&E染色的方法检测肺脏的病理损伤；通过ELISA的方法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子的水平；通过RT-PCR的方法检测小鼠肺脏中PR8的滴度；利用流式细胞术和RT-PCR的方法检测肺泡巨噬细胞中M2型巨噬细胞相关标志的表达；利用体内细胞转输和体外增殖抑制实验验证M2型巨噬细胞的功能；通过上述一系列的研究方法,我们取得了如下实验结果：1、S. aureus预先致敏保护小鼠抵抗流感病毒导致的死亡我们采用1×107CFU的S. aureus滴鼻处理小鼠建立S. aureus小鼠上呼吸道共生模型。之后,我们给小鼠滴鼻感染致死剂量的流感病毒PR8,发现S. aureus预先致敏可以保护小鼠抵抗PR8感染导致的死亡,并且这种抵抗死亡的机制是通过减轻PR8感染所诱导的免疫损伤实现的。2、S. aureus致敏诱导的保护作用依赖于TLR2的活化在Tlr2-/-小鼠中,S. aureus预先致敏不能保护小鼠抵抗PR8感染导致的死亡。通过进一步免疫病理分析和细胞因子检测,我们发现在Tlr2-/-小鼠中,S.aureus预先致敏不能减轻PR8感染所诱导的免疫损伤。因此,S. aureus致敏介导的保护作用依赖于TLR2的活化。3、S. aureus致敏诱导的保护作用不依赖于病毒滴度的降低通过比较对照小鼠与S. aureus致敏小鼠在PR8感染过程中肺脏中的病毒滴度,我们发现S. aureus致敏能够降低PR8感染过程中小鼠肺脏中的病毒滴度。进而,发现S. aureus致敏的WT小鼠和S. aureus致敏的Tlr2-/-小鼠肺脏中的病毒滴度没有显著性的差异。因此,S. aureus致敏诱导的保护作用并不依赖于抑制病毒的增殖。4、S. aureus致敏诱导的保护作用依赖于肺泡巨噬细胞(AMs)S. aureus致敏能显著提高AMs的数目和AMs表面TLR2的表达。采用CL2MDP-lip清除AMs,发现在清除AMs的小鼠中S. aureus预先致敏不能保护PR8导致的死亡。通过转输实验,我们发现S. aureus致敏来源的AMs能够恢复AMs清除小鼠抵抗PR8导致的死亡的能力。因此,S. aureus致敏诱导的保护作用是AMs依赖的。5、TLR2活化营造的肺泡环境促进AMs向M2型巨噬细胞极化我们发现S. aureus致敏能够显著提高M2型巨噬细胞相关标志Arg1,Fizz1,IL-10和TGF-p在AMs中的表达。S. aureus致敏能够诱导WT小鼠BALF中IL-13的水平显著升高,而Tlr2-/-小鼠中则没有。因此,TLR2活化营造的肺泡环境有助于AMs向M2型巨噬细胞极化。6、M2型巨噬细胞抑制PR8感染过程中炎症细胞的招募和增殖通过对PR8感染后BALF中的炎症细胞进行分析,我们发现S. aureus致敏能够显著降低BALF中NK细胞,中性粒细胞以及T细胞等炎症细胞的数目。通过体外实验,发现S. aureus致敏小鼠来源的AMs能够显著地抑制Con A诱导的T细胞的增殖。综上所述,本研究通过建立S. aureus小鼠上呼吸道共生模型,发现S. aureus致敏能够保护小鼠抵抗PR8感染导致的死亡,这种保护作用依赖于减轻PR8感染诱导的免疫损伤而并不依赖于抑制病毒的增殖。在S. aureus致敏过程中,TLR2活化所营造的肺泡环境能够促进AMs向M2型巨噬细胞极化,进而抑制PR8感染过程中炎症细胞的招募和增殖。Ⅱ、呼吸道流感病毒感染诱导Th17细胞依赖的小肠免疫损伤在本部分中,通过给小鼠滴鼻接种流感病毒PR8建立感染模型；利用H&E染色的方法检测组织的病理损伤；通过血清中ALT和BUN水平判断肝脏和肾脏的功能是否正常；通过CBA的方法检测血清中细胞因子的水平；通过PCR的方法检测组织中流感病毒是否存在；利用流式细胞术检测Th17细胞；利用RT-PCR的方法检测小肠中IL-17A, IFN-γ, IL-6, TGF-β和CCL25的表达；利用抗生素清除小鼠肠道共生菌；利用中和抗体阻断体内IL-17A和CCL25的作用。通过上述一系列的研究方法,我们取得了如下实验结果：1、流感病毒感染诱导小肠免疫损伤在小鼠呼吸道流感病毒感染模型中,我们发现PR8感染在引起肺脏免疫损伤的同时还会引起小肠免疫损伤,而不会引起肝脏和肾脏的损伤。在肺脏中能够检测到流感病毒的存在而在小肠中却检测不到。因此,流感病毒呼吸道感染能够诱导小肠免疫损伤,并且这种损伤不是由病毒直接感染所致。2、流感病毒感染诱导小肠中Th17细胞富集通过小肠组织基因芯片分析,我们发现PR8感染后小肠中RORyt的表达水平升高。进而,我们发现伴随着PR8感染,小肠上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层内淋巴细胞(LPL)中CD4+T细胞和Th17细胞逐渐增多,但在肠系膜淋巴结,纵膈淋巴结和外周血中却没有检测到Th17细胞的存在。同时,PR8感染会上调小肠组织中IL-17A的表达而下调IFN-y的表达。抗体中和IL-17A能够抑制PR8诱导的小肠免疫损伤。因此,流感病毒感染引起的小肠免疫损伤是Th17细胞依赖的。3、肠道共生菌的清除减轻流感病毒感染诱导小肠免疫损伤通过检测,我们发现PR8感染后肠道中总细菌数没有发生改变。利用抗生素清除肠道共生菌后,PR8的感染不能诱导小肠免疫损伤发生,同时,在小肠IEL和LPL中Th17细胞也不存在了。因此,肠道共生菌参与PR8感染诱导的小肠免疫损伤。4、肠道共生菌促进CD4+T细胞的招募和Th17细胞的极化通过小肠组织基因芯片分析,我们发现PR8感染能够上调小肠中CCL25的表达。同时,我们发现PR8感染后纵膈淋巴结和小肠中CCR9+CD4+T细胞的数目都明显增加了。进而,我们发现肠道共生菌的清除会降低IL-6, TGF-β和CCL25在小肠中的表达。因此,肠道共生菌可能通过促进CCL25的表达来招募CCR9+CD4+T细胞,并且通过维持IL-6和TGF-β的产生促进Th17细胞的极化。综上所述,本研究发现流感病毒呼吸道感染能够引起小鼠的小肠免疫损伤。在流感病毒感染过程中,小鼠小肠中Th17细胞的数目和IL-17A的表达水平都发生了明显增加。利用抗生素清除肠道共生菌能够保护小鼠抵抗流感病毒诱导的小肠免疫损伤,其机制可能是肠道共生菌营造的特殊微环境能够促进T细胞的招募和Th17细胞的极化。