高等真菌是具有较高创新系数的生物,从高等真菌子实体和发酵液中分离得到的化合物化学结构变化多样,且具有的生物活性也很丰富。我们从棕灰口蘑Tricholoma pardinum中分离得到了一系列口蘑三萜类化合物。前期研究发现,这些化合物普遍具有较强的细胞毒性,但其机制却尚未发现,因此我们选用结构新颖的口蘑三萜类化合物LFTP-85为代表,进一步研究这一类化合物的抗肿瘤机制。本课题采用人宫颈癌细胞系Hela为主要材料,研究了化合物LFTP-85对Hela细胞的毒性、凋亡、胞内活性氧水平、细胞周期和线粒体功能的影响,同时研究了化合物对细胞内凋亡、周期及线粒体凋亡等相关蛋白及基因表达的影响,最终确定其抗肿瘤机制。首先采用MTT法研究LFTP-85对Hela细胞的毒性,发现其半数抑制浓度IC₅₀为16.34μM;其次采用流式细胞术研究了LFTP-85对Hela细胞凋亡、胞内活性氧水平和细胞周期的影响,发现化合物可以诱导Hela细胞发生凋亡,LFTP-85作用浓度增高,凋亡早期和凋亡晚期的细胞数都随之增加,同时LFTP-85提高了Hela细胞内活性氧水平,引起了细胞周期紊乱,并使Hela细胞阻滞于G₂/M期。采用蛋白免疫印迹法研究药物对Hela细胞内凋亡相关的caspase家族蛋白和p53蛋白的表达水平的影响,发现药物处理24 h后,细胞内procaspase 9被激活,引发caspase级联反应,cleaved caspase 9激活procaspase 3的自我切割,切割产生的cleaved caspase 3激活PARP自我切割产生cleaved PARP片段;同时化合物LFTP-85诱导了p53蛋白过表达。LFTP-85处理Hela细胞24 h后,G₂/M期相关周期蛋白cyclin B1和周期蛋白依赖激酶CDK1的表达量均受影响;采用RT-PCR法研究药物对细胞周期相关基因表达水平的影响,发现药物处理后G₂/M期相关基因cyclin B1,P21,P27的mRNA表达量也受到影响,此结果与流式结果一致。据此推测此化合物诱导的凋亡通路可能与线粒体凋亡相关。采用JC-1法检测线粒体膜电位变化,发现LFTP-85作用24 h后,线粒体膜电位降低;采用蛋白免疫印迹法检测Bcl-2家族蛋白的表达,结果显示促凋亡蛋白Bax表达显著上调,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显减少,Bax/Bcl-2的比值显著增加;同时,检测线粒体内和胞质内细胞色素c的含量发现药物诱导线粒体释放细胞色素c。综上所述,化合物LFTP-85通过调控线粒体表面凋亡相关Bcl-2家族蛋白的表达,改变了线粒体膜通透性,降低了线粒体的膜电位,导致细胞色素c从线粒体内膜中释放出来,激活了半胱天冬酶（caspase）级联反应,从而激活PARP自我切割,直接导致了细胞凋亡;同时LFTP-85激活了p53蛋白过表达,导致细胞周期调控紊乱;而p53蛋白过表达及线粒体功能缺失也提高了细胞内的活性氧水平,间接导致细胞凋亡。