含硼酸的磁性聚合物复合微球的制备、表征及糖蛋白分离应用

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近年来,随着蛋白质组学的快速发展,糖蛋白质组学的研究也逐渐成为生命科学研究领域中又一个新的前沿和热点。蛋白质糖基化作为一种非常重要的翻泽后修饰,在蛋白质的结构和功能上有着显著影响,但由于目前的生物质谱技术对于低丰度的糖蛋白/糖肽的分析无能为力,为了解决这个实际难题,许多糖蛋白/糖肽的分离富集技术应运而生。磁性聚合物复合微球由于具有高磁响应性、制备简单、结构粒径可控等优势,也被广泛研究以及应用于糖蛋白/糖肽的分离和富集。正是基于这样的背景,本论文围绕糖蛋白的分离富集展开,研究了磁性聚合物复合微球的制备及相关性能,主要包括以下三个方面的内容:(1)首先采用改进的溶剂热法制备了亚微米级单分散的磁性Fe304粒子,并通过改变不同的反应物混合方法、反应时间以及反应物FeC13的用量,实现Fe304粒径在90~370nm范围内可控。然后利用稀硝酸溶液对磁性Fe304粒子进行快速洗涤,除去粒子外表面因被环境氧化而失磁/失活的部分,提高磁性Fe304粒子的反应活性。再通过溶胶-凝胶法制备磁性Fe3O4@SiO2复合微球,硅层厚度约27nm、粒径为280±15nm的磁性二氧化硅微球具有较高的磁饱和强度(52.9emu/g);同时二氧化硅壳层的厚度也可以通过调节前躯体正硅酸乙酯(TEOS)的加入量,实现在10~70nm范围内可控。(2)利用Fe3O4@SiO2微球具有良好磁响应性的特点,使用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)在二氧化硅表面进行修饰,使磁性Fe3O4@SiO2微球表面带上双键,然后以Fe3O4@SiO2-MPS为种子,二甲基丙烯酸乙二醇酯(EMGDA)为交联剂,过硫酸钾(KPS)为引发剂,将含硼酸的单体对乙烯基苯硼酸(VPBA)分别和甲基丙烯酸甲酯(MMA)或苯乙烯(St)在磁性微球表面共聚,通过调节投料单体MMA:VPBA和St:VPBA的比值,制备得到了不同单体配比的磁性聚合物复合微球Fe3O4@SiO2@P(MMA-co-VPBA)系列和Fe3O4@SiO2@P(St-co-VPBA)系列。这些磁性聚合物微球都具有良好的形貌结构,较窄的粒径分布和较高的磁响应性。其中,当MMA:VPBA和St:VPBA均为1:1时,所制得的微球单分散性最好,并且具备较高的磁响应性,可以在磁铁作用下快速富集,并在简单震荡下重新均匀分散于介质中,具有作为快速分离富集材料的潜力。(3)将制备的磁性聚合物复合微球应用于糖蛋白的分离中,聚苯乙烯(PS)由于具有非特异性吸附,会影响聚对乙烯基苯硼酸(PVPBA)对于糖蛋白的选择性吸附,所以不适合用St作为共聚单体进行糖蛋白分离,而聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)对糖蛋白没有非特异性吸附,所以MMA可以用来作为VPBA的共聚单体,来分离糖蛋白。接着,针对Fe3O4@SiO2@P(MMA-co-VPBA)系列中单分散性最好、吸附能力相对最强的磁性聚合物复合微球Fe3O4@SiO2@P(MMA-co-VPBA)-50研究了不同pH值和吸附时间对于糖蛋白分离的影响,找到了分离糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)的最优条件:环境pH值8.4左右、吸附时间40min以上。并进一步将磁性聚合物复合微球Fe3O4@SiO2@P(MMA-co-VPBA)系列置于糖蛋白HRP和非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)的混合介质中,进行糖蛋白分离纯化实验,通过SDS-PAGE电泳进行表征。结果表明,由MMA和VPBA共聚得到的Fe3O4@SiO2@P(MMA-co-VPBA)微球(最高HRP的吸附量为7.63mg/g,糖蛋白吸附效率为77.5%)比纯VPBA均聚得到的Fe3O4@SiO2@PVPBA微球(HRP吸附量为7.16mg/g,吸附效率为69.9%)分离效果更好一些。总体上,为解决糖蛋白质组学分析中的低丰度糖基化蛋白的分离、富集、鉴定等重要问题提供了新颖有效的研究手段和解决方法。
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