蛋白复合物Slx4-Rtt107在DNA非同源末端连接修复中的作用与机制研究

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同源重组和非同源末端连接是修复DNA双链断裂损伤最主要的两条途径。然而,相比于同源重组过程已经得到较好的阐释,非同源末端连接中还有很多未了解的过程。NHEJ修复一般分为两种类型,一种是精确连接修复,另一种是非精确连接修复,在本研究中,我们对分子支架蛋白Slx4和Rtt107在NHEJ修复中的作用和机制进行了探究,并取得如下研究结果。1)我们发现Slx4和Rtt107形成复合物,参与非精确连接的NHEJ修复过程。我们使用基于染色质的DSB研究系统,发现在缺失了SLX 或RTT107的细胞内非精确连接的NHEJ修复效率严重降低,但是精确连接修复并不受到影响,另一方面,SLX4或RTT107的缺失也不影响基于质粒的NHEJ修复。此外,仅仅破坏Slx4与Rtt107的相互作用也会导致非精确连接的NHEJ修复效率显著降低,表明Slx4和Rtt107的相互作用在NHEJ修复中具有重要作用。2)通过染色质免疫共沉淀实验,我们检测到Slx4和Rttl07在DSB处显著富集,表明这些蛋白是直接结合到损伤处参与NHEJ修复的。接下来,我们对NHEJ过程中的关键核心蛋白,如Mre11、Yku70、Dn14和Po14在损伤处的结合进行了检测,我们观察到SLX4或RTT107的缺失并不影响这些蛋白的结合,暗示着Slx4-Rtt107并不是通过影响NHEJ关键蛋白在损伤处的结合来发挥作用的。3)我们对修复后连接处的序列进行了检测,与野生型细胞相比,我们发现SLX4或RTT107的缺失会导致非精确修复后连接类型发生改变。在野生型细胞中,使用非精确NHEJ修复后的序列含有15%的插入突变,以及85%的缺失突变,然而在slx4Δ或rtt107Δ细胞中,高达80%以上的细胞含有插入突变,而只有约15%左右的细胞是缺失突变,这暗示着,Slx4和Rtt107影响插入和缺失突变类型的形成。4)序列分析显示,这种连接类型的改变可能与末端加工过程有关。与野生型相比,我们发现缺失了R4D1的细胞表现出与slx4Δ或rtt107Δ细胞中类似的连接类型的改变。Rad1和Rad10形成异源二聚体,参与单链融合修复和微同源末端连接修复过程中3’-flap的移除,该结果暗示了上述连接类型的改变可能是由于末端加工中3’-flap的移除异常引起的。在对radlΔslx4Δ和radlΔrtt107Δ双敲除突变体的进一步检测中我们发现,Slx4-Rtt107和Rad1处于同一条通路中,它们共同参与3’-flap的移除。5)在单链融合修复里,支架蛋白Saw1参与依赖于Rad1的3’-flap移除。在本研究中,我们发现Saw1也参与NHEJ中该移除过程,且与Slx4-Rtt107、Rad1处于同一条通路中。6)我们对Rad1在DSB附近的结合量进行了检测,通过ChIP实验发现,缺失了SLX4 RTT107或SAW1的细胞表现出Rad1结合量的显著降低,这个结果直接暗示了 Slx4-Rtt107和Saw1在靶定Rad1结合到损伤处参与3’-flap移除中发挥了重要的作用。7)重要的是,敲除了SLX4或RTT107后,也显著降低了 Saw1在损伤处的结合量。我们认为,Slx4-Rtt107复合体协助Saw1在DNA损伤处结合,Saw1在染色质上的稳定结合进而招募Rad1-Rad10核酸酶,后者完成对3’-flap的加工。显著地,仅仅破坏了 Saw1与Rad1相互作用或Slx4与Rtt107的相互作用,也同样导致Rad1的结合量减少,这些结果暗示了,Saw1和Rad1、以及Slx4和Rtt107的相互作用,对于Rad1在DSB处的结合都尤为重要。以上结果说明,Slx4-Rtt107,Saw1,以及Rad1-Rad10在染色质上有序地装配结合,共同协调完成对NHEJ过程中产生的3’-非同源末端的加工,任一因子的丧失都会导致Rad1在损伤位点的结合量显著减少,进而导致3’-flap移除缺陷。支架蛋白在DNA损伤末端的这种多重布置使得Rad1的募集能够被高度调控,使得细胞可以对3’-flap的加工程度进行精细调节,以适应修复过程中产生的不同类型的末端产物。本研究对于更进一步了解NHEJ中的末端加工过程及其调控机制具有重要意义。
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