对于雌性哺乳动物来讲,每个繁殖周期都有大量卵泡生长,大部分卵泡在发育过程中发生闭锁、退化而消失;只有极少卵泡能发育成熟至排卵。卵泡闭锁的本质是卵巢颗粒细胞凋亡,因此抑制卵巢颗粒细胞凋亡对于提高动物繁殖效率具有重要意义。早期对BDNF的研究主要集中在对神经元的增殖、分化以及成熟等神经系统疾病。后来发现,BDNF在生殖系统中同样具有重要作用。BDNF可促进卵巢颗粒细胞分泌雌激素、促进第一极体排出、卵母细胞成熟和排卵。MiRNA为一类小的内源性非编码RNAs,大小一般为19～25碱基,通过与靶基因3’UTR结合,发挥对基因表达的转录后调控。自miRNA发现以来,miRNA研究主要停留在癌症的发病机制及治疗上。近年来,miRNA对生殖调节及生殖疾病的研究也日趋增多。通过miRNAs的一些数据库可知,BDNF是miR-15a的一个靶基因。然而有关猪卵泡发育和闭锁的研究中还未见miR-15a及BDNF的相关报道。因此,本研究采用免疫组化及qPCR方法研究了中等健康、闭锁卵泡中miR-15a和BDNF的表达差异;分离培养卵泡颗粒细胞,探究BDNF对卵巢颗粒细胞PCNA基因和蛋白表达影响以及过表达或抑制miR-15a表达对卵泡颗粒细胞内BDNF基因表达及蛋白水平影响。有文献报道,凋亡蛋白p53促进miR-15a表达上调;而雌激素抑制卵巢颗粒细胞p53表达。因此闭锁卵泡中雌激素很可能通过调节p53、miR-15a进而调控BDNF。本实验研究雌激素对卵巢颗粒细胞miR-15a和BDNF的影响。从而揭示卵泡中由于雌激素减少导致miR-15a上调,进而降低BDNF蛋白造成卵泡闭锁。研究结果如下:(1)免疫组化结果显示,BDNF在中等健康卵泡中蛋白水平最高,在大、小卵泡中蛋白水平较低。与中等健康卵泡相比,中等闭锁卵泡中BDNF基因表达较高,但蛋白水平较低;TrkB基因表达及蛋白水平在闭锁卵泡中较高。(2)分别抽取直径3～5mm、大于5 mm卵泡和3～5 mm闭锁卵泡颗粒细胞,采用qPCR检测,结果显示闭锁卵泡中miR-15a显著升高。而中等、大卵泡中表达较低。(3)分离培养中等卵泡颗粒细胞,使用阿霉素处理颗粒细胞,结果显示p53基因表达显著升高(p<0.05);miR-15a表达同样显著升高(p<0.05)。(4)雌激素抑制miR-15a表达(P<0.05)。(5)雌激素促进BDNF蛋白生成(p<0.05)。(6)过表达miR-15a能显著上调BDNF基因表达(p<0.05);但蛋白水平却显著下调(p<0.05);抑制miR-15a表达则能显著抑制BDNF基因表达(p<0.05),然而其蛋白水平却显著升高(p<0.05)。(7)BDNF处理卵巢颗粒细胞,能显著上调颗粒细胞PCNA基因和蛋白表达水平(p<0.05)。