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银杏树是银杏科银杏属唯一生存的老树种之一，其叶和果有重要的药用价值，在我国银杏作为药用已有五千多年的历史。现代医学证明：银杏叶含有多种药用成分，是制作“三抗”(抗血栓、衰老、癌变)、“两防”(防心脑血管疾病、老年痴呆)、“两提高”(提高智商、免疫力)的新药主料。其制剂不仅被广泛用于心脑血管疾病、神经及精神性疾病等方面的治疗，而且在老年性疾病的治疗方面也取得一定成效，已成为其国内外的畅销药品，更有许多国家已将其作为保健品、保健品中的添加物甚至食品添加剂长期使用。
本课题组已经报道：大鼠连续10天灌胃给药GBE 100mg/kg可显著诱导大鼠肝药酶CYP3A1、CYP1A2和CYP2B的酶活性、基因表达和蛋白表达，并可导致大鼠口服普萘洛尔后体内代谢的增加。但是由于种属差异的原因，不能直接推导到人，因此需要进一步的研究GBE对人CYP450酶的影响及诱导机制。
GBE有两大有效成分：黄酮类化合物和萜内酯类化合物。本课题组已系统研究主要黄酮类化合物(槲皮素和山萘酚)对大鼠体内P450的影响，发现槲皮素和山萘酚仅能诱导大鼠体内CYP1A2，而对CYP3A1、CYP281/2、CYP2C11、CYP2C7、CYP2E1和CYP2D2没有影响。萜内酯类化合物是银杏中特有的化合物，迄今尚未发现存在于其他任何植物中，目前没有系统研究萜内酯单体对CYP4.50酶影响的报道。因此本研究的主要目的是：从酶活性、基因表达和蛋白表达三个方面研究GBE对人、大鼠原代肝细胞中CYP3A的影响，比较种属差异；系统研究GBE的三个主要萜类单体白果内酯(BB)、银杏内酯A(GA)和银杏内酯B(GB)对大鼠体内CYP450酶的影响，分析其在GBE诱导作用中的地位；进一步研究诱导CYP3A的机制。
一、人、大鼠原代肝细胞模型的建立和验证目的：建立人和大鼠原代肝细胞培养模型，为下一步药物诱导实验提供一定数量的正常细胞。
方法：采取简单易行而且经济的方法，对经典“二步”灌流法和胶原铺被方法的改进后，成功地建立了人和大鼠原代肝细胞培养模型。胎盼蓝染色后观察存活率，记录细胞数量。RT-PCR检测人原代肝细胞贴壁后连续六天CYP3A4 mRNA的表达。利用经典的阳性诱导剂利福平(RIF，5O μM)在贴壁第四天后，分别与人原代肝细胞共同孵育24、48和72小时后，RT-PCR检测CYP3A4 mRNA的表达，确定进行药物诱导实验时间。
结论：采取了简单易行而且经济的方法，成功建立人和大鼠原代肝细胞模型，可为下一步的实验提供一定数量的正常细胞，选择在原代肝细胞贴壁培养72小时后，给予药物，并共同孵育72小时，进行药物诱导实验。
二、银杏叶提取物(GBE)、白果内酯(BB)和银杏内酯B(GB)对人和大鼠原代肝细胞中CYP3A的影响研究目的：研究GBE、BB和GB对人和大鼠原代肝细胞中CYP3A的影响，并比较种属差异。
方法：在人和大鼠原代肝细胞贴壁72小时后，GBE(100、500和2500 ng/mL)、BB(2、10和50 ng/mL)和GB(2、10和50 ng/mL)分别与细胞共同孵育72小时。LC/MS/MS检测酶活性，RT-PCR检测基因表达，Western-blotting检测蛋白表达。
结论：GBE能诱导人和大鼠原代肝细胞中CYP3A，人和大鼠不存在种属差异。BB能诱导人和大鼠原代肝细胞中CYP3A蛋白表达，GB对其没有影响。提示BB很可能在GBE诱导CYP3A作用占重要地位，但需要体内实验进一步证实。
三、白果内酯、银杏内酯B和银杏内酯A(GA)对大鼠体内CYP450酶的影响研究目的：系统研究三个主要萜类单体(BB、GB和GA)对大鼠体内CYP450酶(CYP3A1、CYP1A2、CYP2E1、CYP281/2、CYP2C7、CYP2C11和CYP2D2)的影响。
方法：100 mg/kg剂量的GBE，0.3、1.5、3、10和30 mg/kg剂量的BB，1.5、10和30 mg/kg剂量的GA，1.5、10和30 mg/kg剂量的GB，连续灌胃给予SD雄性大鼠10天，地塞米松(DEX)100 mg/kg连续腹腔注射4天，β-萘黄酮(β-NF)80 mg/kg连续腹腔注射3天，20％7,醇水溶液5 mL/kg连续灌胃4天，苯巴比妥(PB)80 mg/kg连续腹腔注射3天。LC/MS/MS“Cocktail”法检测酶活性，RT-PCR检测基因表达，Western-blotting检测蛋白表达。
结论：BB能显著诱导大鼠体内CYP3A1、CYPlA2和CYP281/2，是使GBE产生肝药酶诱导作用(尤其是对CYP3A和CYP281/2)的主要成分；GA和GB仅诱导大鼠体内CYP1A2，对CYP3A1和CYP281/2没有影响；三个单体对CYP2C7、CYP2C11和CYP2D2均没有影响。阐明了BB是GBE诱导CYP450酶的主要成分，为单体新药开发提供参考信息和依据。
四、银杏叶提取物和白果内酯对CYP3A诱导机制的研究从四个方面研究GBE和BB对CYP3A的诱导机制。
一)、目的：研究GBE、BB、GA和GB是否能通过孕烷X受体(PXR)的活化而诱导CYP3A4转录。
方法：GBE(100 ng/mL、500 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)、BB(10 ng/mL、100ng/mL、1μg/mL和10 μg/mL)、GB(10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL和10 μg/mL)和GA(10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL和10μg/mL)，与转染了600 ng/孔pTK-(3A4)3-Luc报告基因质粒和100 ng/孔pCMX-hPXR表达质粒的CV-1细胞共同孵育24小时，测定细胞中荧光素酶。结果：GBE(100 ng/mL、500 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)分别活化PXR 1.55、1.76、1.8和2.21倍，BB(10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL和10μg/mL)分别活化PXR 1.77、1.85、2.1和0.97倍，GA和GB不能活化PXR。
二)、目的：基于NFκ-B p65能与PXR竞争性结合RXRα的现象来研究GBE和BB对大鼠原代肝细胞中RXRα和NFκ-B p65的蛋白表达的影响。
方法：GBE(1和10 μg/mL)和BB(1μg/mL)分别与大鼠原代肝细胞共同孵育72小时后，Western-blotting检测细胞中RXRα和NFκ-B p65的蛋白表达。
三)、目的：研究GBE和BB对CYP3A抑制剂脂多糖(LPS)的拮抗作用。
方法：DEX(10 μM)、GBE(100、500和2500 ng/mL)和BB(3、15和75 ng/mL)分别与空白培养基、LPS(5μg/mL)、LPS(5 μg/mL)+DEX(10μM)共同孵育72小时后，Western-blotting检测其大鼠原代肝细胞中CYP3A1的蛋白表达。
四)、目的：进一步研究GBE抑制NF-κB的机制。
方法：GBE(350 ng/mL、700 ng/mL、3.5μg/mL和7μg/mL)预处理26小时后与TNFα共同孵育后，Western-blotting检测IκBα蛋白表达的变化；GBE 5μg/mL预处理后，转染了pNF-κB-Luc的Hela细胞中荧光素酶的活性。
结果：与未预处理组相比，经TNFα处理Hela细胞30min后，IκBα被磷酸化，并且由于降解其含量明显减少，然而经不同浓度银杏叶提取物预处理的Hela细胞和未处理组相比较，经TNFα再处理细胞30min后，IκBα减少未见明显差异；TNFα刺激组荧光素酶活性高于空白组4-5倍，而经银杏叶提取物预处理后荧光素酶的活性显著降低。结论：通过以上研究表明：1)GBE和BB能通过PXR的活化而诱导CYP3A4转录；GA和GB不能活化PXR，对CYP3A4转录无诱导作用；2)GBE和BB均不能通过增加RXRα蛋白表达或减少NFκ-Bp65蛋白表达来影响PXR通路，从而产生诱导CYP3A的作用；3)GBE和BB不仅可以拮抗LPS对CYP3A1蛋白表达抑制作用，而且对LPS降低DEX诱导CYP3A1蛋白表达产生拮抗，其中BB的拮抗能力弱于GBE，提示GBE和BB可能抑制NF-κB增强PXR活性；4)GBE不能抑制TNFa诱导的IκBα的磷酸化和降解，但对TNFα诱导的NF-κB基因转录活性有抑制作用。
本研究证实了GBE能显著诱导人原代肝细胞中CYP3A4；系统阐述了BB、GA和GB对大鼠体内CYP450的影响，其中BB是GBE诱导CYP3A1、CYP281/2和CYP1A2的主要成分，GA和GB为GBE诱导CYP1A2贡献了力量；GBE租BB能通过对PXR5通路的激活和对NF-κB负调节的抑制来诱导CYP3A。这些结果为GBE和萜类单体与其他药物相互作用提供理论基础，为预防和减轻植物药与药物间的相互作用、最大限度的提高药物的有效性和安全性以及临床的合理联用药物提供依据，为萜类单体新药开发提供参考信息和理论基础。