[研究背景]糖尿病血管病变是糖尿病患者致死、致残的主要原因之一。血管内皮的炎症反应在血管病变的发生、发展中扮演着重要角色。糖尿病被认为是一种低度炎症性疾病,高糖毒性引起的血管内皮炎症是糖尿病血管病变发生的重要机制。以往研究证实,细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及环氧化酶-2(COX-2)作为炎性因子与心血管疾病等的发病过程密切相关。硫化氢作为一种新型的气体信号分子,在原发性高血压、失血性休克、心肌梗死等心血管疾病中起保护作用。当前研究表明,硫化氢具有广泛的生物学效应,如抑制心肌损伤、影响细胞凋亡及细胞增殖过程以及调节胰岛素释放等,这都与其抑制炎症反应的作用密不可分。但硫化氢在糖尿病血管病变发病过程中的作用目前尚不十分明确。基于上述研究现状,为了更深入得探讨硫化氢与高糖诱导的内皮细胞炎症的关系,以便为糖尿病血管病变的靶向治疗提供新的实验依据,我们开展了相关研究。本研究确定的研究目的及方法如下：[目的]1.通过外源性硫化氢处理人脐静脉内皮细胞,观察硫化氢对炎症因子ICAM-1、COX-2蛋白及mRNA表达的影响,探讨硫化氢对炎症相关指标的作用。2.观察硫化氢对NF-κB核转移及NF-κB-DNA结合活性的影响,探讨硫化氢抑制炎症反应的机制。[方法]1.采用0.125%胰酶和0.01%EDTA灌注法获得人脐静脉内皮细胞原代,置于含10%胎牛血清的M199培养基中,放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,第2、3代细胞用于实验。当细胞融合度达70%-80%时,换成含2%胎牛血清的培养基中继续培养。(1)将细胞分为6组：正常糖浓度组(5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(16.7mmol/L葡萄糖)、高糖+25μmol/L硫氢化钠组、高糖+50μmol/L硫氢化钠组、高糖+100μmol/L硫氢化钠组、正常糖浓度+100μmol/L硫氢化钠组,为保证各组渗透压一致,用甘露醇平衡正常组及正常+硫氢化钠组的渗透压。培养相应时间后,测定细胞内RelA/NF-κBp65的活性以及ICAM-1的表达。(2)将TNF-α处理后的细胞分为6组：正常组、10ng/ml TNF-α组、TNF-α+5μmol/L乙酰半胱氨酸(NAC)组、TNF-α+25μmol/L硫氢化钠组、TNF-α+50μmol/L硫氢化钠组、TNF-α+100μmol/硫氢化钠组。培养相应时间后,测定细胞内ICAM-1的表达。2.将人脐静脉内皮细胞株接种于DMEM完全培养基中,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当细胞融合度达70%-80%时,换成含2%胎牛血清的培养基继续培养,同时将细胞分为4组：正常糖浓度组(5.5mol/L葡萄糖)、高糖组(16.7mmol/L葡萄糖)、高糖+100μmol/L硫氢化钠组、正常糖浓度+100μmol/L硫氢化钠组,为保证各组渗透压一致,用甘露醇平衡正常组及正常+硫氢化钠组的渗透压。培养相应时间后,测定细胞内RelA/NF-κB p65的活性以及COX-2的表达。[结果](1)与正常组相比,高糖处理48h和72h时ICAM-1的蛋白表达显著增加(p<0.01)。(2)与正常组相比,高糖组ICAM-1蛋白(p<0.01)及mRNA(p<0.05)的表达量显著增加,硫氢化钠可以剂量依赖性的抑制其表达的增加。(3)与正常组相比,高糖组COX-2蛋白(p<0.01)及mRNA(p<0.01)的表达量显著增加,100μmol/L硫氢化钠可以抑制其表达的增加。(4)与正常组相比,TNF-α处理组的ICAM-1蛋白表达量显著增加(p<0.01),硫氢化钠及乙酰半胱氨酸(NAC)可以抑制其表达的增加。(5)与正常组相比,高糖组p-IKBα/IκBα比值显著增加(p<0.01),硫氢化钠可以剂量依赖性的抑制其比值的增加。(6)与正常组相比,高糖可促进RelA/p65向核内转移,100μmol/L硫氢化钠可以抑制其转移。(7)与正常组相比,高糖组RelA/NF-KB p65与DNA的结合活性增强,硫氢化钠可以抑制高糖诱导的RelA/NF-KB活性的增强。[结论](1)高浓度葡萄糖可增加内皮细胞内炎症因子ICAM-1的表达。(2)硫化氢可以抑制高糖诱导的炎症因子ICAM-1、COX-2表达的增加,从而减轻高糖引起的内皮细胞炎症。(3)硫化氢通过抑制NF-κB的核转移及其活性,抑制相关炎症因子的表达。