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溶菌酶能够水解细菌细胞壁中β-1,4糖苷键,破坏细胞壁肽聚糖结构,是一种安全性高的药品、饲料食品添加剂。市场上销售的溶菌酶主要是从鸡蛋清中提取。相比于鸡溶菌酶,人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)具有生物活性高、稳定性好,具有较高的应用价值。受限于原料来源、提纯精制成本等因素,人源溶菌酶制备量较少,不能满足需求。本论文通过共表达分子伴侣Kar2p、ERO1p、转录因子Hac1p及优化基因剂量,研究其对毕赤酵母KM71菌株表达人溶菌酶水平的影响,期望得到高效表达人溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌株。(1)根据GenBank中Kar2p、ERO1p和Hac1p基因序列,设计引物,构建重组载体pG418-Kar2p、pG418-ERO1p和p9K-Hac1p。采用电击转化法,将构建的重组载体整合于含人溶菌酶基因的重组酵母菌株KM71-pPIC-hLYZ-3基因组中,在含G418的YPDS平板上筛选得到共表达分子伴侣Kar2p、ERO1p和人溶菌酶的工程菌株 KM71-pPIC-hLYZ-Kar2p-5、KM71-pPIC-hLYZ-ERO1p-7,以及共表达转录因子Hac1p和人溶菌酶的工程菌株KM71-pPIC-hLYZ-Hac1p-11。工 程 菌 株 KM71-pPIC-hLYZ-3、KM71-pPIC-hL YZ-Kar2p-5、KM71-pPIC-hLYZ-ERO1p-7 和 KM71-pPIC-/hLYZ-Hac1p-11 经甲醇诱导 168h,分析其摇瓶表达人溶菌酶水平。4种工程菌株分泌的胞外总蛋白量分别为361.02±11.97μg/mL、518.99±17.92μg/mL、339.68±28.69μg/mL 和440.35±26.95μg/mL。发酵上清液所产酶活分别达到40400±1898.13U/mL、48240±4145.87U/mL、37480±2493.15U/mL 和 52800±3259.84U/mL。对工程菌株分泌的胞外总蛋白及人溶菌酶活力分析表明,共表达分子伴侣ERO1p对重组菌株表达人溶菌酶无显著影响;共表达分子伴侣Kar2p对重组菌株表达人溶菌酶有显著影响,菌株KM71-pPIC-hLYZ-Kar2p-5所产胞外总蛋白分泌水平和人溶菌酶活力较菌株KM71-pPIC-hLYZ-3分别提高了 43.76%和19.41%;共表达转录因子Hac1p对重组菌株表达人溶菌酶有促进作用,菌株KM71-pPIC-hLYZ-Hac1p-11所产胞外总蛋白量和溶菌酶活力较菌株KM71-pPIC-hLYZ-3分别提高了 21.97%和 30.69%。(2)利用BamH Ⅰ和Bgl 1Ⅱ互为同尾酶,以携带1拷贝hly基因的重组质粒pPIC-hLYZ为基础,构建了含有2、4、6拷贝hly基因的重组质粒pPIC-2hLYZH、pPIC-4hLYZH和pPIC-6hLYZH。采用电击转化方法,将构建的含多拷贝hly基因的重组质粒整合于毕赤酵母KM71菌株基因组中,在含Zeocin的YPDS平板上筛选得到工程菌株 KM71-pPIC-hLYZ-8、KM71-pPIC-hLYZ-3、KM71-pPIC-2hLYZH-5、KM71-pPIC-4hLYZH-3 与 KM71-pPIC-6hLYZH-4。荧光定量PCR确定上述工程菌株分别含有1、3、2、4、6拷贝的人溶菌酶基因。将含0、1、2、3、4、6拷贝人溶菌酶基因的工程菌株进行甲醇诱导168h,分析其摇瓶表达人溶菌酶水平。6种工程菌株发酵上清液蛋白含量分别为69.09±11.31μg/mL、178.62±32.52μg/mL、212.32±7.00μg/mL、353.68±12.77μg/mL、436.99±26.08μg/mL 和 334.02±11.97μg/mL,发酵上清液酶活力分别为 0±0U/mL、23700±339.41U/mL、30200±565.69U/mL、49000±1175.76U/mL、61900±2036.47U/mL 和 57000±2899.93U/mL。含 4 拷贝hly基因的重组菌株KM71-pPIC-4hLYZH-3所产胞外总蛋白量和酶活力最高,其胞外总蛋白分泌水平和酶活力较含1拷贝hly基因的重组菌株KM71-pPIC-hLYZ-8分别提高了 1.45倍和1.61倍。整合6拷贝hly基因的重组菌株KM71-pPIC-6hLYZH-4所产胞外总蛋白表达量和酶活力较整合4拷贝hly基因的重组菌株KM71-pPIC-4hLYZH-3分别少 23.6%和 7.92%。(3)将构建的分子伴侣重组载体p9K-Hac1p整合于含4拷贝hly基因的重组菌KM71-pPIC-4hLYZ-3基因组中,在含G418的YPDS平板上筛选得到共表达转录因子 Hac1p 的菌株 KM71-pPIC-4hLYZ-Hac1p-8。共表达转录因子Hac1p的菌株KM71-pPIC-4hLYZH-Hac1p-8经甲醇诱导168h,分析其摇瓶表达人溶菌酶水平。KM71-pPIC-hLYZ-8、KM71-pPIC-4hLYZH-3和KM71-pPIC-4hLYZH-Hac1p-8菌株发酵上清液分泌蛋白量分别为196.51±5.25μg/mL、453.59±7.08μg/mL 和 517.82±4.19μg/mL,发酵上清液中酶活力分别达到 23200±1064.64U/mL、64800±2372.75U/mL 和 78600±1134.95U/mL。菌株KM71-pPIC-4hLYZH-Hac1p-8所产胞外总蛋白表达量和酶活力较菌株KM71-pPIC-4hLYZH-3 分别提高了 14.16%和 21.30%。工程菌株KM71-pPIC-4hLYZH-Hac1p-8蛋白分泌水平和人溶菌酶活力分别达到菌株KM71-pPIC-hLYZ-8的2.64倍和3.39倍。优化基因剂量和共表达转录因子Hac1p显著提高了人溶菌酶在毕赤酵母KM71菌株中的表达水平。