人腺苷酸激酶hAK1广泛存在于人体的各个器官中,在能量平衡,磷酸化等过程中发挥重要作用,许多疾病的发生与hAK1的功能异常有关。在Mg2+的作用下,hAK1能够可逆的催化两分子的ADP,生成一分子AMP和一分子ATP,其中AMP又是AMPK信号通路的重要调控因子。因此,揭示AK1发挥功能的结构基础,有助于我们在分子水平上理解hAK1的催化机制。前期的NMR实验结果表明,Mg2+和ADP的加入,使hAK1中很多氨基酸的谱峰发生变化。在本论文中,我们对其中一些谱峰发生扰动的氨基酸进行了突变。通过酶活力测定,生物膜层干涉以及分子对接等方法,揭示了 hAK1与Mg2+以及与ADP的相互作用,找到了 hAK1发挥功能的关键氨基酸,为设计和开发调控hAK1功能的小分子化合物提供理论依据。对比分析核磁化学位移扰动的实验结果,我们选取了 Mg2+的滴定扰动位点6个:G22,C25,H36,T39,D93,G94;ADP 的滴定扰动位点:G16,G18,G20,G22,C25,L37,S38,T39,G40,R44,E62,V67,V72,G94,R132,S136,D140,D141,Q65,D93,E176,T157以及G13,V29,D78,E103共26个位点。通过定点突变,最终构建了突变体的重组质粒,并表达纯化得到27个突变体蛋白。酶活力测定的结果表明,H36A,G94A,D93A,G22A对酶活力的影响达到50%以上,是Mg2+结合的重要位点。这些位点位于磷酰基转移中心靠近CORE结构域的地方,Mg2+在这个口袋上,协助蛋内高效完成的磷酸基团转移。另外,我们对于ADP滴定引起的扰动位点进行了突变体的构建、酶活力和底物结合力测定。实验表明,G16,G20,G40,R44,G94,D140和D141这7个氨基酸位于ADP末端的磷酸基团转移中心,可以使hAK1酶活力以及与ADP的结合力显著降低,在hAK1结合底物并发生催化反应的过程中发挥关键作用。生物膜层干涉实验表明,位于空腔两端,ADP腺苷结合附近的位点Q65,R132,E176,V72,由于远离磷酸基团转移中心,因而对酶活力的影响不像上述位点那么显著,但它们与ADP的作用力会显著降低。因此,它们主要负责结合捕捉ADP;而位于中部磷酸基团附近的G22,D93,这些位点的突变体仅能够大幅度降低酶活力,在与ADP的结合上影响不大。因其也是Mg2+的结合位点,所以我们推测它们主要通过Mg2+催化ADP。最后,通过分子对接,我们得到,ADP结合到hAK1的口袋上,其腺苷部分主要通过Pi-烷基等疏水作用结合,其磷酸部分主要通过氢键作用得到固定。根据这一口袋的结构信息,我们从药物库里筛选了潜在的结合AK1蛋白的药物分子,这些药物分子对hAK1的结构和功能的影响,还需要进一步的实验验证。综上所述,本论文通过定点突变、生物膜层干涉实验和酶活力功能实验,确定了 hAK1催化ADP生成ATP和AMP过程中,Mg2+和ADP的结合位点,以及对AK1酶活力有影响的关键氨基酸。我们进一步通过分子对接,对hAK1与ADP之间的作用模式进行了探讨。该研究不仅有助于理解由hAK1异常而引起疾病的分子机制,还为hAK1抑制剂或激动剂的开发提供了基础。