研究背景与研究目的:干细胞是一类具有自我更新能力的未分化细胞,主要包括胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和间充质干细胞。间充质干细胞因其来源广泛、易获取、免疫原性低及有一定分化潜能等优点,在抗衰老、器官移植、组织损伤修复及多种疾病治疗中得到广泛应用。然而,干细胞体外扩增时因干性基因容易丢失及干细胞移植到体内因干细胞微环境的变化而不能分化为特定功能细胞等问题限制了其临床应用。干细胞生存的微环境决定了干细胞的命运如静息、自我更新或分化,干细胞的生存微环境包括细胞外基质、机械应力、拓扑学及可溶性细胞因子等成分。尽管目前已有模拟体内环境的纳米形貌学细胞外基质模型（纳米柱、纳米凹陷、沟槽面、梯度渐变的纳米柱或沟槽面和纳米纤维）及模拟体内机械应力（1D、2D和3D）的体外仿生模型应用于干细胞的培养,但传统调节纳米形貌模型的制作方法较为复杂、成本高、耗时且不利于放大生产,从而限制了其应用。电纺丝纳米纤维制作简单方便、可放大至工业级别,成本低、效益好,可作为生物制造材料。目前,采用不同结构且不同尺寸大小的电纺丝纳米纤维或模拟体外3D机械应力对干细胞行为的研究尚未见报道。本研究旨在制备不同结构和尺寸大小的电纺丝纳米纤维模型以及制作以周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜为基底的细胞培养装置,即电纺丝纳米纤维与3D机械应力结合的联用模型,并分别对它们在干细胞命运中的调控作用进行深入研究,从而为模拟干细胞微环境的新型细胞发酵罐及器官芯片的设计与应用提供理论基础和实验依据。实验方法:1.不同排列和不同孔隙大小的电纺丝纳米纤维膜的制备:1)首先搭建了一个静电纺丝制备平台,然后使用Sim4Life V5.0.1软件对电纺装置中的电场进行了模拟;2)为了制备不同排列和不同孔隙大小的电纺丝纳米纤维膜,设计了制备随机排列和垂直交叉排列电纺丝纳米纤维膜的收集器;3)普通光学显微镜观察并分类筛选电纺丝纳米纤维膜,进行SEM鉴定,并使用Image J分析图片和Graph Pad Prism统计数据。2.不同排列及不同孔隙大小的电纺丝纳米纤维膜对骨髓间充质干细胞的影响:1)首先制作PDMS上下环,再将其与制备的不同排列及不同孔隙大小的电纺丝纳米纤维膜粘合,从而得到三明治样的细胞培养装置,再使用氧等离子体-真空等离子清洗机对其进行亲水化处理,再浸入于75%的乙醇并紫外消毒30 min,最后使用50μg/m L的I型胶原蛋白溶液37℃过夜包被;2)MTT检测细胞增殖情况;3)q PCR检测干细胞的干性基因、分化基因及PIEZO1的表达情况;4)油红O染色检测hMSCs的成脂分化;5)ALP染色检测hMSCs的成骨分化;6)免疫荧光检测细胞形态。周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底对骨髓间充质干细胞的影响:)首3.周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底对骨髓间充质干细胞的影响:1)首先使用3D打印制备底层气动室层、中层软基质室层和顶层细胞培养室层PDMS模块的模具,再使用PDMS溶液分别浇筑在对应的模具上,75℃固化2小时制备相应的PDMS模块,接着使用PDMS薄膜、软基质PDMS、电纺丝纳米纤维膜分别与对应的PDMS模块组合制备出底层气动室层、中层软基质室层和顶层细胞培养室层,最后三层可逆结合组装成周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底培养装置;2)MTT检测细胞增殖情况;3)q PCR检测干细胞的干性基因、分化基因及PIEZO1的表达情况;4)油红O染色检测hMSCs的成脂分化;5)ALP染色检测hMSCs的成骨分化;6)免疫荧光检测细胞形态及YAP在hMSCs的细胞核和细胞质中的分布情况。实验结果:1.小孔隙和中孔隙随机排列及中孔隙和大孔隙垂直交叉排列的电纺丝纳米纤维膜:1)Sim4Life V5.0.1软件对电纺装置中的电场进行模拟得到收集器电极表面的电场矢量俯视图,结果显示电纺装置中的电场分布与设计的收集器表面电极的形状有关;2)设计得到了可制备随机排列电纺丝纳米纤维膜的10层堆积叠加粘合在一起的铝箔胶带的收集器表面电极及可制备垂直交叉排列电纺丝纳米纤维膜的两对平行排列的铜条的收集器表面电极;3)得到了不同排列和不同孔隙大小的电纺丝纳米纤维膜,RS的孔隙平均面积为8.54±1.82μm2,RM的孔隙平均面积为23.33±3.28μm2,MM的孔隙平均面积为20.97±4.56μm2,ML的孔隙平均面积为62.59±39.72μm2。2.不同排列及不同孔隙大小的电纺丝纳米纤维膜调控hMSCs的命运:1)MTT和q PCR检测显示,综合5种不同基底对hMSCs细胞增殖的促进和相关干性基因维持效果的排序,应用于hMSCs干细胞体外扩增（在维持干性基因的前提下,尽可能多地促进细胞增殖）的综合排序为:小孔隙随机排列（RS）、中孔隙随机排列（RM）、PCL薄膜（PCL film）、中孔隙垂直交叉排列（MM）、大孔隙垂直交叉排列（ML）;2)油红O染色显示,中孔隙和大孔隙垂直交叉排列的电纺丝纳米纤维膜可抑制hMSCs的细胞成脂分化;3)ALP染色显示,小孔隙和中孔隙随机排列的电纺丝纳米纤维膜可促进hMSCs的细胞成骨分化;4)免疫荧光染色显示,hMSCs在5种不同基底的细胞铺展由大到小,由易到难的排序为:PCL薄膜（PCL film）、小孔隙随机排列（RS）、中孔隙随机排列（RM）、大孔隙垂直交叉排列（ML）、中孔隙垂直交叉排列（MM）;5)q PCR检测显示,随着培养时间的增加,hMSCs的PIEZO1基因表达量出现不同程度的降低,这与随着培养时间的增加而hMSCs的相关干性基因的表达下降的变化一致,并且与随着培养时间的增加而hMSCs的细胞增殖数量也增加的变化相反。3.周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底调控hMSCs的命运:1)MTT和q PCR检测显示,周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底可以维持hMSCs的干性并促进细胞增殖;2)油红O染色和ALP染色显示,周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底促进hMSCs的成脂分化并抑制其成骨分化;3)免疫荧光染色显示,周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底可以促使hMSCs细胞铺展由多个方向上的各向异性转变为各向同性,细胞铺展更容易,也就更容易进行细胞增殖;4)免疫荧光染色显示,周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底可以诱导hMSCs细胞核中的YAP进入细胞质;5)q PCR检测显示,周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜基底上的hMSCs的PIEZO1基因表达量增加,且在培养7天和14天后的差异都显著。结论:1.采用一个十层堆积叠加粘合的铝箔胶带和两个对称排列的铜条电极在不同的电纺沉积时间下可分别制备小孔隙和中孔隙随机排列及中孔隙和大孔隙垂直交叉排列的电纺丝纳米纤维膜。2.电纺丝纳米纤维膜的排列和孔隙大小可调控hMSCs的命运。对比5种不同的hMSCs培养基底,即小孔隙和中孔隙的随机排列的电纺丝纳米纤维膜（RS/RM）、中孔隙和大孔隙的垂直交叉排列的电纺丝纳米纤维膜（MM/ML）及PCL薄膜（PCL film）:9天和14天后的体外扩增实验中,小孔隙随机排列（RS）可较好地促进hMSCs的体外扩增。14天后的体外分化实验中,中孔隙和大孔隙垂直交叉排列的电纺丝纳米纤维膜抑制hMSCs的细胞成脂分化。小孔隙和中孔隙随机排列的电纺丝纳米纤维膜促进hMSCs的细胞成骨分化。3.周期性三维拉伸电纺丝纳米纤维膜为基底的细胞培养装置,即电纺丝纳米纤维与3D机械应力结合的联用模型,可以调控hMSCs的命运。与静止的中孔隙电纺丝纳米纤维膜相比,体外扩增实验中,周期性三维拉伸7天后,可以进一步维持hMSCs的干性、并诱导细胞铺展,14天后细胞增殖数量显著增加;体外分化实验中,周期性三维拉伸14天后,可促进成脂分化并抑制成骨分化。