研究背景:血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁中膜的主要组分,具有收缩和合成细胞外基质的功能,成体内血管平滑肌细胞呈静止-收缩表型,表达一系列收缩相关蛋白,很多蛋白也是VSMCs常用的分化标记蛋白。但是与终末分化的心肌细胞、骨骼肌细胞不同,它具有显著的可塑性,允许它们对各种环境刺激做出反应。分化的VSMCs可以根据需要或在微环境刺激引导下,发生结构、功能和分子水平的整体性改变,可逆地从静止/收缩转变为迁移/增殖/合成表型,称为表型转换。这种表型转换能力是维持血流动力学稳定和血管修复的重要机制,然而若外界环境持续刺激或包内信号传导通路紊乱,细胞可能持续激活,表现为增殖或合成功能活跃,或持续分泌促炎细胞因子,从而造成血管结构和功能紊乱,引起并促进多种血管疾病的进展。TWIST1是重要的调控细胞分化的转录因子之一,人类研究和功能性动物实验表明TWIST1可能参与了血管疾病,前期我们一项研究证实在平滑肌细胞中特异性敲除TWIST1可防止肺血管重构,但目前关于它在血管重构的发生、发展及作用机制知之甚少。基于以上背景,我们想要探究TWIST1是否参与VSMCs的表型转变引起血管重构并促进血管疾病的发生和发展,期待寻找到血管疾病治疗的新的靶点。研究方法:1.PDGF-BB诱导体外培养的血管平滑肌细胞发生表型转换,检测TWIST1的表达用促进VSMCs去分化的血小板源性生长因子-BB（platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）处理细胞,通过细胞免疫荧光和蛋白电泳WB检测TWIST1的表达变化。2.体外实验验证TWIST1与血管重构和平滑肌细胞表型转换的关系分别用TWIST1 si RNA病毒和TWIST1 c DNA病毒及相应的阴性对照病毒转染VSMCs,造成TWIST1基因沉默和过表达的细胞模型,通过蛋白电泳WB分别比较TWIST1基因沉默和过表达与相应对照组细胞之间VSMCs分化标志性蛋白的表达,通过细胞免疫荧光观察细胞形态和细胞骨架变化,验证TWIST1与VSMCs表型转换的关系。用TWIST1抑制剂harmine处理VSMCs,比较细胞分化标志性蛋白表达有无差异。3.在大鼠颈动脉损伤血管重构模型验证TWIST1与血管重构和平滑肌细胞表型转换的关系实验组使用球囊栓子切除导管造成颈动脉血管急性损伤后缝合伤口,对照组在颈动脉相同位置做切口,不损伤血管内膜直接缝合。在特定时间点处死小鼠,取损伤节段颈动脉组织做病理切片。用免疫荧光、组织蛋白电泳WB等方法比较对照组和实验组TWIST1在血管壁和平滑肌细胞中的表达。4.TWIST1影响VSMCs表型转变的机制研究（1）生物信息学搜索查询TWIST1与SMA启动子是否有直接作用,是否直接调控分化标志蛋白平滑肌细胞α-肌动蛋白（smooth muscleα-actin,SMA）的转录。（2）在细胞模型中,通过q-RTPCR验证TWIST1与促进VSMCs分化的micro RNA-143/145之间的关系;通过蛋白电泳WB分析TWIST1与维持收缩表型的重要蛋白p68之间的关系。（3）探究TWIST1与p68的作用机制。利用人主动脉平滑肌细胞,通过免疫共沉淀试验验证TWIST1和p68有无蛋白-蛋白相互作用;利用蛋白酶体抑制剂处理细胞,验证TWIST1是否通过其蛋白酶体活性影响细胞内p68的表达;对已转染TWIST1 si RNA病毒的细胞再次转染p68 si RNA病毒或对照GFP si RNA病毒,比较VSMCs micro RNA-143/145及分化标志性蛋白的表达,验证TWIST1是否通过p68影响micro RNA-143/145的表达,继而影响表型改变。研究结果:1.PDGF-BB体外诱导实验PDGF-BB刺激后,血管平滑肌细胞发生表型转换,表现为分化标志性蛋白表达减少,细胞形态改变,同时TWIST1表达上调。且随着PDGF-BB刺激时间和浓度增加,TWIST1上调幅度增大。2.体外实验验证TWIST1与血管重构和平滑肌细胞表型转换的关系在TWIST1抑制剂处理和TWIST1基因沉默的VSMCs中,分化标记性蛋白SMA、平滑肌肌球蛋白重链（smooth muscle myosin heavy chain,SMMHC）、肌钙蛋白（calponin）、肌动蛋白结合蛋白（transgelin,Tagln）表达增加,细胞呈现收缩功能的梭形形态,在TWIST1基因过表达模型中,分化标记蛋白表达减少,细胞形态由梭形变得更圆。3.在大鼠颈动脉损伤血管重构模型验证TWIST1与血管重构和平滑肌细胞表型转换的关系与对照组相比,实验组动物血管管壁增厚,免疫荧光提示VSMCs所在的中膜层增厚,细胞内SMA表达减弱,在增厚的血管中膜中,TWIST1表达增加。4.TWIST1影响VSMCs表型转变的机制（1）生物信息学检索Cistrome DB数据库提示TWIST1不是SMA的转录因子,不直接调控SMA的转录。（2）TWIST1与micro RNA-143/145、p68呈负相关,即TWIST1过表达模型中,micro RNA-143/145、p68转录水平降低,p68蛋白表达减少,TWIST1沉默模型中,micro RNA-143/145、p68转录水平提高,p68蛋白表达增加。（3）生物信息学检索Cistrome DB数据库提示TWIST1不作为p68的转录因子直接调控p68的转录;血管平滑肌细胞免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）实验提示TWIST1与p68可直接结合,用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,TWIST1过表达的VSMCs和对照组细胞p68均增加,过表达组几乎可以逆转TWIST1对p68的下调作用,说明TWIST1可通过其蛋白酶体活性发挥下调p68的作用。（4）与转染p68 si RNA阴性对照病毒的TWIST1基因沉默细胞相比,转染p68 si RNA病毒可抑制VSMCs分化标记蛋白的表达及形态的改变,并减低micro RNA-143/145的表达,部分逆转TWIST1基因沉默对VSMCs的作用。结论:1.TWIST1上调参与了PDGF-BB诱导的体外培养的VSMCs表型转换的生物学过程;2.对于体外培养的VSMCs,TWIST1抑制VSMCs分化标记蛋白的表达,促进收缩形态改变,促进表型转换;TWIST1表达上调参与了大鼠颈动脉损伤引起的血管中膜结构改变及平滑肌细胞表型转换的过程。3.TWIST1对平滑肌细胞分化标记蛋白SMA无直接转录调节作用,而是通过下调p68和micro RNA-143/145诱导平滑肌细胞表型转换。TWIST1通过抑制p68的转录并促进其降解抑制p68的表达,p68表达下调可通过减少micro RNA-143/145表达促进VSMCs表型转换。