大肠杆菌是一种条件性致病菌,能引起动物以及人类的败血症、尿路感染等疾病。临床中滥用和过度使用抗生素加剧了耐药菌的出现。β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素一直被作为重要的治疗药物选择使用,这类药物的滥用所产生的选择压产生了多重耐药菌。其机制之一就是质粒所介导的能水解β-内酰胺环的β内酰胺酶的产生。ESBLs可以水解β-内酰胺环,且通过质粒介导的形式在细菌间传播,携带有这种酶的细菌可以水解相应的抗生素从而导致治疗的失败。这是目前革兰氏阴性菌耐药的主要原因之一。编码ESBLs的基因存在于质粒上,其基因型有多种,目前发现的有CTX-M、SHV、TEM、OXA等类型,CTX-M型是目前最主要的β-内酰胺酶类型。在之前的几十年里,产ESBLs大肠杆菌的存在于不同的环境中均已被报道过,其中包括食物、食品性的动物、不同的水环境特别是污水。由于人和动物源的耐药菌通过各种排放渠道最终将会进入到水环境中,其携带的耐药基因有可能在水环境种的细菌之间进一步传播。市政废水处理厂是人和动物源微生物的重要的储存器,这些耐药菌可以通过污水厂的出水口重新进入到周围环境中去,例如水和食物,很有可能反过来再次感染人和动物。因此,一旦产ESBL肠杆菌通过污染的食物或饮用水进入到人和动物肠道内,很可能导致耐药基因在人和动物体内传播,甚至造成严重的感染。污水中存有大量的细菌和抗生素,非常有利于细菌间的接合,并促进携带耐药基因的可移动元件发生水平转移。细菌通过可移动元件传递耐药性是耐药性扩散的主要机制,可移动原件包括接合质粒和转座子等,具有获得和传播外来基因的能力。本研究主要针对于泰安市某污水处理厂中分离到的产ESBLs大肠杆菌,对其进行耐药表型及Β内酰胺类和喹诺酮类耐药基因的检测,分析其多重耐药性及对周围环境所产生的影响。以期为大肠杆菌病的防制和临床用药的风险评估提供科学依据,并为今后养殖业合理有效地使用抗菌药提供参考。并进行接合试验,将大肠杆菌接合前后耐药表型及耐药基因的变化进行对比,从而探讨可移动质粒在耐药性传播过程中所发挥的作用。1.污水产ESBL大肠杆菌的流行特点为了解泰安污水处理厂产ESBL肠杆菌的流行及特点。从污水处理厂共采集了160份样品。通过使用选择性培养基的分离培养,并经16S rRNA PCR检测、测序、基因库对比,获得140份阳性样品,分离率高达87.5%。经ESBLs确证实验(双纸片协同测试法)确定分离产ESBL大肠杆菌100份,分离率为62.5%。经ERIC分析,将≥90%相似性的菌株去除,将剩余的50株产ESBL大肠杆菌作为后续试验的实验样本。该结果表明,泰安市污水处理厂污水已被产ESBL肠杆菌严重污染,成为耐药基因的储存器,且污水经过处理后并不能消除全部的产ESBL肠杆菌的污染。2.污水产ESBL大肠杆菌的耐药性选择当地人和动物临床常用的19种抗生素药敏片,参照CLSI(M100-S22,2012)标准操作规范进行试验。根据美国临床实验室标准委员会,对菌株抑菌环直径分析判定,记录结果分为敏感(S)、耐药(R)、中介(I),并统计各试验株的耐药谱以及多重耐药等情况。结果显示,所分离得产ESBL大肠杆菌耐药性较严重,均呈现多重耐药性(multi-drug resistant,MDR)。本实验为临床上合理的使用抗生素提供了可靠的依据。3.污水厂产ESBL大肠杆菌的流行病学分析对污水厂分离的50株产ESBL肠杆菌携带耐药基因进行检测,均检测到bla基因。其中blaTEM、blaCTX-M基因检出率为100%(50/50),仅有两株未检测到blaSHV基因。检出的50份bla基因中多为blaTEM-1、blaSHV-11和blaCTX-M-15型。没有检测到qrA基因,检测到五株菌中含qrB基因(a5,a22,b2,b4,c5)和32株菌中含qrS基因。通过pcr反应对质粒上携带的耐药基因进行检测,检测结果与基因组携带情况一致,说明这些耐药基因全部位于质粒上,由质粒携带。结果表明由于β-内酰胺类和氟喹诺酮类药物的滥用产生的选择性压力导致了携带多种耐药基因及毒力基因的细菌的产生。要进一步监测blaCTX-M、blaSHV、blaTEM基因型的传递,为临床上合理的使用抗生素提供可靠的依据。4.污水产ESBL大肠杆菌通过接合水平传递耐药性的研究接合是在基因水平上传递耐药性最常见的方式,在耐药基因的传播过程中起到了十分重要的作用。为证明,耐药基因可通过水平传递。参考膜过滤接合法(filter mating method)进行接合试验,经ERIC-PCR及药物选择性平板验证,50株产ESBLs且耐头孢噻肟的供体菌共接合成功35株接合子,接合成功率高达70%,对35株接合成功的大肠杆菌进行15种抗菌药物的耐药表型检测结果分析可以看出接合子均表现出一定的耐药表型。通过对接合子携带的耐药基因进行PCR检测,得出各耐药基因的携带情况,从中可以看出TEM和CTX-M基因全部接合成功,SHV仅有两株未接合成功,供体菌与其接合子均不携带OXA、qnrA基因,24株携带qnrS基因的供体菌仅一株发生转移,2株携带qnrB基因的供体菌未发生耐药基因的转移。结果表明,产ESBL大肠杆菌通过接合水平传递耐药性。5.ESBLs耐药质粒全序列分析编码ESBLs基因通常位于质粒上,并通过接合、转座作用转移和传播。我们选取了接合子WA8作为分析对象。采用鸟枪法构建文库方法进行DNA测序并利用生物信息学方法分析了其编码基因和结构。质粒wwA8(GenBank MG773378)为一闭环DNA分子,83157 bp,GC含量为52.74%,共含有45个预测基因。wwA8携带三个已知耐药基因,blaCTX-M-15、blaTEM-1、QnrS1,体外接合菌的耐药表型及耐药基因检测结果与质粒测序结果一致,证明水源E.coli耐药基因在体外有转移能力。