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【目的】
1.制备重组纤溶酶抑制剂rNaKuI10的高密度发酵的初步研究
2.离子交换层析一步法亲和纯化rNaKuI10的初步研究
3.rNaKuI10的抗纤溶作用初步研究
【方法】
1.rNaKuI10重组制备高密度发酵的初步研究
本实验室前期从美洲板口线虫(Necator americanus)中分离出来一种新的蛋白多肽，命名为rNaKuI10。构建了重组表达质粒pET32a-sumo/NaKuI10，转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得rNaKuI10重组表达菌，然后至5L发酵罐进行高密度，通过监测溶氧以及OD600值的变化，添加补料，通过调整转速、控制通气量控制溶氧，当菌液达到一定密度时用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rNaKuI10，对rNaKuI10重组蛋白表达菌进行高密度发酵。
2.离子交换层析一步法亲和纯化rNaKuI10的初步研究
采用阳离子交换柱(SP高流速琼脂糖微球)，应用AKTA蛋白纯化系统，通过改变层析缓冲液(结合缓冲液及洗脱缓冲液)的pH以及盐离子浓度，初步确定SUMO蛋白酶切后的rNaKuI10的洗脱条件；通过用发色底物法检测100倍蛋白酶摩尔浓度的rNaKuI10对5nmol/L人纤溶酶(底物S2388浓度为400μmol/L)的酶活性抑制情况，检测5%甘露醇是否能够增加rNaKuI10的稳定性，并检测rNaKuI10的热稳定性以及rNaKuI10复冻融稳定性。
3.rNaKuI10的抗SD大鼠纤溶作用初步研究
选用SPF级SD大鼠25只，随机分为5组(每组5只)，分别为假手术组，模型组，rNaKuI10低、中、高剂量组。0.4%戊巴比妥钠1.5mL?kg-1腹腔注射麻醉后，在开始尾静脉注射组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator， t-PA)输注后10分钟开始通过留置针尾静脉注射0.2mg?kg-1、0.6mg?kg-1、1.8mg?kg-1rNaKuI10多肽，15min后将大鼠尾部垂直，用mm尺测量并用记号笔在距离尾尖1cm处作好标记，然后快速剪短，记录出血时间。
【结果】
1.对rNaKuI10重组蛋白表达菌在5L发酵罐进行了高密度发酵，获得了湿重约140g/L的rNaKuI10重组蛋白表达菌。
2.通过AKTA蛋白纯化系统，确定在pH6.5的磷酸盐缓冲液条件下进行rNaKuI10与填料的结合，在200mmol/l氯化钠的缓冲液(pH6.5)下进行洗脱可获得纯度相对较高的目的蛋白rNaKuI10；通过酶活性的检测，确定在4℃条件下，5%甘露醇保存rNaKuI10较直接在生理盐水中保存更稳定；rNaKuI10的热稳定性较差，但其对反复冻融的耐受性较好，连续冻融7次，没有明显的活性降低。
3.动物实验结果显示：各给药组的血管出血时间较模型组轻。与模型组相比rNaKuI10低剂量组、中剂量组、高剂量组出血时间均有所降低(P＜0.05)，各组具体出血时间如下：模型组(11.34±0.24)min；低剂量组(9.43±0.27)min；中剂量组(6.50±0.18)min；高剂量组(2.20±0.21)min，但是在各剂量组之间的差异明显(P＜0.05)。
【结论】
本研究通过高密度发酵工艺，获得了rNaKuI10重组蛋白表达菌；初步确定了用阳离子交换柱一步法层析纯化rNaKuI10条件；并通过动物实验研究表明，rNaKuI10对尾出血大鼠具有较好的抗纤溶止血作用，rNaKuI10止血的作用机制还需要深入的研究。
1.制备重组纤溶酶抑制剂rNaKuI10的高密度发酵的初步研究
2.离子交换层析一步法亲和纯化rNaKuI10的初步研究
3.rNaKuI10的抗纤溶作用初步研究
【方法】
1.rNaKuI10重组制备高密度发酵的初步研究
本实验室前期从美洲板口线虫(Necator americanus)中分离出来一种新的蛋白多肽，命名为rNaKuI10。构建了重组表达质粒pET32a-sumo/NaKuI10，转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得rNaKuI10重组表达菌，然后至5L发酵罐进行高密度，通过监测溶氧以及OD600值的变化，添加补料，通过调整转速、控制通气量控制溶氧，当菌液达到一定密度时用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rNaKuI10，对rNaKuI10重组蛋白表达菌进行高密度发酵。
2.离子交换层析一步法亲和纯化rNaKuI10的初步研究
采用阳离子交换柱(SP高流速琼脂糖微球)，应用AKTA蛋白纯化系统，通过改变层析缓冲液(结合缓冲液及洗脱缓冲液)的pH以及盐离子浓度，初步确定SUMO蛋白酶切后的rNaKuI10的洗脱条件；通过用发色底物法检测100倍蛋白酶摩尔浓度的rNaKuI10对5nmol/L人纤溶酶(底物S2388浓度为400μmol/L)的酶活性抑制情况，检测5%甘露醇是否能够增加rNaKuI10的稳定性，并检测rNaKuI10的热稳定性以及rNaKuI10复冻融稳定性。
3.rNaKuI10的抗SD大鼠纤溶作用初步研究
选用SPF级SD大鼠25只，随机分为5组(每组5只)，分别为假手术组，模型组，rNaKuI10低、中、高剂量组。0.4%戊巴比妥钠1.5mL?kg-1腹腔注射麻醉后，在开始尾静脉注射组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator， t-PA)输注后10分钟开始通过留置针尾静脉注射0.2mg?kg-1、0.6mg?kg-1、1.8mg?kg-1rNaKuI10多肽，15min后将大鼠尾部垂直，用mm尺测量并用记号笔在距离尾尖1cm处作好标记，然后快速剪短，记录出血时间。
【结果】
1.对rNaKuI10重组蛋白表达菌在5L发酵罐进行了高密度发酵，获得了湿重约140g/L的rNaKuI10重组蛋白表达菌。
2.通过AKTA蛋白纯化系统，确定在pH6.5的磷酸盐缓冲液条件下进行rNaKuI10与填料的结合，在200mmol/l氯化钠的缓冲液(pH6.5)下进行洗脱可获得纯度相对较高的目的蛋白rNaKuI10；通过酶活性的检测，确定在4℃条件下，5%甘露醇保存rNaKuI10较直接在生理盐水中保存更稳定；rNaKuI10的热稳定性较差，但其对反复冻融的耐受性较好，连续冻融7次，没有明显的活性降低。
3.动物实验结果显示：各给药组的血管出血时间较模型组轻。与模型组相比rNaKuI10低剂量组、中剂量组、高剂量组出血时间均有所降低(P＜0.05)，各组具体出血时间如下：模型组(11.34±0.24)min；低剂量组(9.43±0.27)min；中剂量组(6.50±0.18)min；高剂量组(2.20±0.21)min，但是在各剂量组之间的差异明显(P＜0.05)。
【结论】
本研究通过高密度发酵工艺，获得了rNaKuI10重组蛋白表达菌；初步确定了用阳离子交换柱一步法层析纯化rNaKuI10条件；并通过动物实验研究表明，rNaKuI10对尾出血大鼠具有较好的抗纤溶止血作用，rNaKuI10止血的作用机制还需要深入的研究。