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沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌,分布十分广泛,严重威胁大众健康与安全。由于抗生素的长期大量使用以及很多情况下的滥用,导致沙门氏菌的耐药性问题越来越严重,新的耐药菌株不断出现。质粒作为一种自主复制的可移动元件,广泛存在于沙门氏菌中,并参与其耐药性的水平转移。因此,了解沙门氏菌质粒类型分布,并探究质粒与耐药性之间的关系,对耐药沙门氏菌的预防与防治具有重大意义。本研究的主要内容如下:一、不同来源沙门氏菌血清分型根据O抗原(rfb基因簇)、H1抗原(fliC基因)和H2抗原(fljB基因)分别设计引物进行PCR反应,并与测序相结合,对78株沙门氏菌进行血清型测定,并用传统玻片凝集实验进行验证工作。结果表明PCR方法与测序相结合鉴定沙门氏菌血清型的准确度达98.7%(77/78),仅1株伤寒沙门氏菌的H2抗原出现假阳性结果,且编号为SJTUF10023的自凝菌被鉴定为鼠伤寒沙门氏菌。血清分型结果共获得以鼠伤寒(25/78,32.1%)和肠炎沙门氏菌(12/78,15.4%)为主的21种血清型。二、不同来源沙门氏菌MLST分型与耐药基因分布本研究共获得24个ST型,其中ST34为优势序列型,占所有菌株的23.1%(18/78)。利用MLST可以精确的预测区分不同血清型菌株,聚类的各个分支与血清型基本呈对应关系(75/78,96.2%),其中有3株沙门氏菌(1株阿贡纳、1株阿伯丁和1株斯坦利)的聚类结果与血清型不一致。根据实验室前期工作获得的耐药表型和耐药基因,结合mlst分型结果显示:超过一半的blaoxa-1基因分布于st34菌株中(18/25,72.0%),st34型沙门氏菌对应的血清型为鼠伤寒沙门氏菌,表明鼠伤寒沙门氏菌耐药情况较为严重;78株沙门氏菌耐药表型及耐药基因分布较为分散,mlst分型结果与沙门氏菌耐药表型及耐药基因之间无明显相关性。三、不同来源沙门氏菌的质粒分型利用5组多重pcr和3组单重pcr,共18对引物,对78株菌携带的质粒不相容群(inc)进行筛查,发现78株沙门氏菌中有74株沙门氏菌携带常见的质粒不相容组群,所携带的质粒类型包括9种不相容组群(incp、inchi2、incn、inca/c、incfiis、incfia、incfib、incfic、inci1),其中incp群(45/78,57.7%)和inchi2群(32/78,41.0%)两种不相容群质粒分布最多。与mlst分型结果对比分析发现,st34菌株均携带inchi2质粒,不携带incf质粒(包括incfiis、incfic、incfia、incfib),st11菌株均不携带inchi2质粒。将耐药基因与所携带质粒类型比较发现,携带blacmy-2耐药基因的菌株均携带有inci1和inchi2质粒;携带有qnra耐药基因的菌株基本上均携带有inca/c质粒(4/5,80.0%);携带blaoxa-1耐药基因的菌株中88.0%携带inchi2质粒(22/25),12.0%携带incp质粒(3/25),12.0%携带inci1质粒(3/25);携带blatem-1耐药基因的菌株携带的质粒类型复杂,包括inchi2、incp、inci1和inca/c质粒。将32株具有耐药表型沙门氏菌携带的质粒不相容群与耐药表型相结合,发现共携带5种质粒家族的质粒(inchi2、incp、incf、inci1和inca/c),其中inchi2质粒最为普遍(19/32,59.4%),另外所有携带incn质粒的菌株均没有耐药表型(20/20,100%),绝大部分携带incp质粒的菌株没有耐药表型(39/45,86.7%)。四、耐药沙门氏菌质粒消除与耐药基因定位按照5%sds+lb液体培养基44.5℃培养48h的方法,对32株耐药沙门氏菌进行质粒消除实验,共得到15株耐药表型丢失菌株,消除效率为46.9%。提取15株耐药丢失菌株的质粒发现,消除实验前后质粒谱型发生明显变化。Inc HI2、Inc I1和Inc F都有不同程度的丢失(消除率分别为87.5%、100%、100%),相对的耐药基因acc(6’)-ib-cr、blaOXA-1、blaTEM-1、blaCMY-2、qnrA也有一定程度的丢失(消除率分别为42.9%、80.0%、83.3%、100%、100%)。通过对消除实验前后,沙门氏菌耐药表型、耐药基因及质粒不相容群的分析比较,发现丢失的质粒主要为Inc HI2质粒,β-内酰胺酶类耐药基因(blaOXA-1、bla TEM-1和blaCMY-2)随着Inc HI2质粒的丢失而丢失,相应的耐药表型也随之丢失;携带Inc I1质粒菌株的β-内酰胺酶类耐药基因随着Inc I1的丢失而丢失;携带Inc F家族质粒的菌株的耐药基因随着质粒消除而丢失。5株携带Inc P质粒的菌株中,Inc P质粒没有被消除,但耐药基因和耐药表型都有一定程度的丢失,推测本研究中沙门氏菌耐药性的水平转移主要与Inc HI2质粒有关,与Inc P质粒无关。本文对78株不同来源的沙门氏菌进行了血清分型、MLST分型、质粒分型,旨在了解该菌耐药表型携带情况与血清型分布和ST型分布的关系;在此基础上,利用质粒不相容群分型方法对其质粒携带情况进行筛查,为沙门氏菌携带质粒类型提供了基础数据;最后利用质粒消除方法对耐药沙门氏菌的耐药基因进行定位分析,确定沙门氏菌中流行耐药质粒类型及其携带的耐药基因,为监控沙门氏菌耐药基因的水平传播提供理论依据。