【摘 要】
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为了探索抗冷冻蛋白Ⅲ（Antifreeze proteinⅢ,AFPⅢ）对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的保护作用,并寻找最合适的AFPⅢ添加方式及添加浓度,本研究使用三种不同添加方式（冷冻液、冷冻平衡液、冷冻液与冷冻平衡液）添加AFPⅢ,对不同浓度（250、500、750及1000 ng/m L）AFPⅢ组的MⅡ期卵母细胞分别进行孤雌激活和体外受精实验,检测各组卵母细胞的线粒体含量、ROS含量、ATP含
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为了探索抗冷冻蛋白Ⅲ（Antifreeze proteinⅢ,AFPⅢ）对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的保护作用,并寻找最合适的AFPⅢ添加方式及添加浓度,本研究使用三种不同添加方式（冷冻液、冷冻平衡液、冷冻液与冷冻平衡液）添加AFPⅢ,对不同浓度（250、500、750及1000 ng/m L）AFPⅢ组的MⅡ期卵母细胞分别进行孤雌激活和体外受精实验,检测各组卵母细胞的线粒体含量、ROS含量、ATP含量及线粒体膜电位,并观察线粒体分布及线粒体-溶酶体共定位的情况。以期为改良玻璃化冷冻液配方,减少玻璃化冷冻对小鼠和其他哺乳动物卵母细胞的冷冻损伤提供理论依据。结果发现:1.通过三种不同添加方式分别添加250、500、750与1000 ng/m L AFPⅢ均可提高冷冻后小鼠卵母细胞的存活率、孤雌激活卵裂率与8-细胞率,且三种不同添加方式中500 ng/m L AFPⅢ组的存活率与孤雌激活卵裂率均显著高于其他AFPⅢ添加组（P＜0.05）。其中,在冷冻平衡液和冷冻液中均添加500 ng/m L AFPⅢ时,冻融卵母细胞的孤雌激活8-细胞率显著高于冷冻对照组（P＜0.05）。2.通过三种不同添加方式分别添加250、500、750与1000 ng/m L AFPⅢ均可提高冷冻后小鼠卵母细胞的存活率、体外受精卵裂率及8-细胞率,且三种不同添加方式中500 ng/m L AFPⅢ组的存活率与体外受精卵裂率均显著高于其他AFPⅢ添加组（P＜0.05）。其中,在冷冻平衡液和冷冻液中均添加500 ng/m L AFPⅢ时,冻融卵母细胞的体外受精8-细胞率显著高于冷冻对照组（P＜0.05）。综上所述,在冷冻平衡液与冷冻液中均添加500ng/m L AFPⅢ对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞发育的保护作用最佳,故选用该添加方式及浓度作为以下实验的冷冻方案。3.相比于新鲜对照组,玻璃化冷冻后卵母细胞的线粒体含量显著降低、ROS含量显著升高（P＜0.05）,部分线粒体分布异常且线粒体-溶酶体共定位增多;相比于冷冻对照组,AFPⅢ添加组的卵母细胞线粒体含量显著增高、ROS含量显著降低（P＜0.05）,线粒体分布与新鲜对照组无明显差别,且线粒体-溶酶体共定位减少。因此,AFPⅢ可以显著降低玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的ROS含量,减少玻璃化冷冻引起的线粒体含量减少、分布异常和线粒体-溶酶体共定位。4.相比于新鲜对照组,玻璃化冷冻后卵母细胞的线粒体膜电位及ATP含量显著降低（P＜0.05）,而AFPⅢ添加组的线粒体膜电位及ATP含量显著高于冷冻对照组（P＜0.05）。因此,AFPⅢ对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的线粒体功能具有保护作用。综上所述,在冷冻平衡液及冷冻液中均添加500 ng/m L AFPⅢ有助于改善玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的存活及发育,减少氧化应激并对线粒体及其功能起到冷冻保护作用。
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