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背景癫痫患者及动物模型中均存在突触可塑性及学习认知功能改变。我们的前期研究结果表明Rac1在大脑中的表达增加与癫痫发生有关,Rac1在癫痫动物模型中是否与突触可塑性及学习认知功能改变有关,尚不清楚。本研究采用离体脑片及癫痫动物模型行为学的实验方法。离体脑片采用电生理实验方法,实验分为对照组、Rac1抑制剂组、Rac1激动剂。记录突触后电位(postsynaptic potential,PSP)及HFS诱导地LTP,行为学采用Y型迷宫和Morris水迷宫,实验分为对照组、癫痫组、癫痫组+Rac1抑制剂、癫痫组+Rac1激动剂组。研究探讨了Rac1抑制剂及激动剂对正常大鼠海马区突触可塑性及在癫痫动物模型中观察学习认知功能影响。结果表明Rac1在突触可塑性的重要作用,Rac1激动剂增强了癫痫动物的学习记忆功能,Rac1抑制剂使学习记忆功能受损。目的Rac1激动剂、抑制剂对离体海马脑片突触可塑性及在癫痫动物模型中观察对学习认知功能的影响。方法1.电生理:突触后电位(postsynaptic potential,PSP)的记录和LTP的诱发 实验动物为4周龄的SD大鼠,将10%水合氯醛注射进腹腔进行麻醉,迅速用手术刀打开胸腔,用预先冷冻的切片液经灌流,看到四肢变白后,迅速断头取脑组织,立即放置于于切片液中。用振动切片机将海马沿水平方向切割为400μm的厚度,迅速将含有海马的脑片转移至记录槽,持续灌流在人工脑脊液(温度在控制30℃～32℃)充有混合气体(95%O2+5%CO2)。将脑片移至记录槽,将刺激电极放在CA3区谢弗侧枝(Schaffer collateral)并刺激该通路,将记录玻璃电极CA1区放射层(SR)并记录PS,稳定记录15-30分钟后,用高频刺激(HFS)诱导LTP,记录1小时。在药物持续存在的条件下,为测试特异性的Rac1激动剂或拮抗剂对LTP的作用,在HFS前药物预处理脑片15-20分钟。2.Y迷宫:Y迷宫广泛应用于功能衰退,方向性和空间工作记忆等研究领域。Y迷宫主要用于研究啮齿动物动态空间的工作记忆。它完全基于实验动物的性质来探索新的和不同的环境。因为动物每次改变探测方向都需要记住先前探测的方向,Y迷宫实验可以有效地确定动物的空间工作能力。新手臂中记忆损坏探测器的时间和距离将缩短。3.Morris水迷宫实验 水迷宫实验具体方法如下:(1)定位航行实验:以4个象限的某一个固定点为起点,平台为终点,将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠由起点游至终点的时间,即逃逸潜伏期,实验允许最大逃逸潜伏期为120s,每组每只大鼠从四个象限各入水一次,记录逃离潜伏期。每天在固定时间进行,共持续5天。并保持环境温度等条件不。(2)空间探索实验:撤去平台,将大鼠放于平台的相对象限入水,记录120s内穿越平台区域的次数以及在平台象限内的游泳时间。数据采集和处理由水迷宫图像自动监视处理系统完成。将各组各亚组成绩进行比较。逃离潜伏期是一个重要的实验指标,它的时间长短反映了动物学习记忆能力好坏,逃离时间越短预示着学习记忆能力越好。4.实验分组(1)离体脑片采用电生理实验方法:实验分为对照组、30umol/l、60umol/lRac1抑制剂组,60nmol/l、300nmol/lRac1激动剂组。(2)采用和匹罗卡品癫痫动物模型,采用Morris水迷宫和Y型迷宫实验方法分别观察对照组、癫痫组、癫痫组+NSC23766、癫痫组+ML099对大鼠学习认知功能的影响。5.统计分析所有统计测试使用Sigmastat软件进行。统计所有统计测试使用Sigmastat软件进行(SPSS公司,加利福尼亚州,美国)。采用单因素方差分析(ANOVA)分析来确定HFS诱导的不同组间的LTP之间的差异。组与组间比较采用Bonferronis Multiple Comparison。P<0.05的值被认为是统计学上显着的。结果图1:Rac1抑制剂影响晚期LTP,并成浓度依赖 Rac1抑制剂NSC23766(60umol/l)降低了大鼠LTP。尤其表现在在HFS后55-60分钟(由1.463±0.117降低为0.99±0.22 P<0.002*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,单因素方差分析后进行事后配对t检验,正常对照组:n=5,30μmol/L组:n=6;60μmol/L组n=6)。图2:Rac1激动剂明显增加LTP Rac1激动剂ML099明显增加大鼠LTP。尤其表现在HFS后55-60分钟,60nmol/l与对照组比较(由1.463±0.117增加为2.078±0.254 P<0.01),300nmol/l与对照组比较(由1.463±0.117增加为1.869±0.167 P<0.001)单因素方差分析后进行事后配对t检验,正常对照组:n=5,60nmol/L组:n=5;300nmol/L组n=7。图3:Y型迷宫新异臂探索时间显示(1)癫痫组较对照组学习记忆能力受损,具体为癫痫组新异臂探索时间较对照组新异臂探索时间明显减少,由156.0±14.85减少为107.02±10.13,P<0.05.(2)癫痫+NSC23766组较对照组学习记忆能力受损,癫痫+NSC23766组新异臂探索时间较对照组新异臂探索时间明显减少,由156.0±14.85减少为62.50±13.03,P<0.05.(3)癫痫+ML099组较癫痫组学习记忆及认知功能明显改善,癫痫+ML099较癫痫组新异臂探索时间明显增加,147.8±20.12比107.02±10.13明显增加,P<0.05。表明Rac1激动剂ML099改善癫痫老鼠学习记忆及认知功能。(4)癫痫+ML099组较癫痫+NSC23766组学习记忆及认知明显增强,癫痫+ML099组较癫痫+NSC23766组新异臂探索时间明显增加,147.8±20.12比62.50±13.03明显增加,P<0.05.图4:Y型迷宫进臂总次数(1)癫痫组较对照组学习记忆能力受损,癫痫组进臂总次数较对照组明显减少,由24.25±1.500减少为15.25±2.630,P<0.05.(2)癫痫+NSC23766组较对照组学习记忆能力受损,癫痫+NSC23766组进臂总次数较对照组明显减少。由24.25±1.500减少为8.000±0.8165,P<0.05。(3)癫痫+ML099组较癫痫组学习记忆及认知功能明显改善,癫痫+ML099较癫痫组进臂总次数明显增加,21.50±3.416比15.25±2.630明显增加,P<0.05。表明Rac1激动剂ML099改善癫痫老鼠学习记忆及认知功能。(4)癫痫+ML099组较癫痫+NSC23766组学习记忆及认知明显增强,癫痫+ML099组较癫痫+NSC23766组进臂总次数明显增加,21.50±3.416比8.000±0.81653明显增加,P<0.05.图5:Morris水迷宫各组逃离潜伏期(1)癫痫组较对照组学习记忆能力受损 癫痫组与对照组比第2、3、4、5天,逃离潜伏期时间延长,由对照组第2天52.97±13.94增加为癫痫组第2天的76.80±11.86 P<0.01;由对照组第3天39.65±10.74增加为癫痫组第3天的59.94±6.239 P<0.05;由对照组第4天23.16±8.906增加为癫痫组第4天的42.21±6.273 P<0.05;由对照组第5天9.763±1.360增加为癫痫组第5天的28.97±3.932 P<0.05。(2)癫痫+NSC23766组较对照组学习记忆能力受损 癫痫+NSC23766组与对照组比第2、4、5天,逃离潜伏期时间延长,由对照组第2天52.97±13.94增加为癫痫+NSC23766第2天的71.96±11.61 P<0.05;由对照组第4天23.16±8.906增加为癫痫+NSC23766组第4天的42.37±6.208 P<0.05;由对照组第5天9.763±1.360增加为癫痫组第5天的29.80±3.313 P<0.05。(3)癫痫组+ML099与对照组学习记忆能力相当 癫痫组+ML099与对照组第1、2、3、4、5天逃离潜伏期时间P>0.05统计学无意义。表明Rac1激动剂ML099可改善癫痫老鼠的学习记忆能力。结论1.Rac1影响大鼠海马区突触可塑性。Rac1抑制剂NSC23766明显降低LTP,呈剂量依赖性。Rac1激动剂ML099明显增加了LTP。2.Rac1激动剂和抑制剂对学习记忆功能有一定影响。癫痫组、癫痫+NSC23766组较对照组学习记忆能力受损,癫痫组+ML099与对照组学习记忆相当,癫痫组+ML099较癫痫组学习认知功能明显改善。