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目前恶性淋巴瘤的治疗有了许多进展，但是残留病灶的存在仍然是导致肿瘤反复复发的主要原因。B细胞淋巴瘤肿瘤细胞表面的免疫球蛋白分子存在独特型位点，是DNA疫苗的理想靶标，因此抗独特型DNA疫苗有可能达到治疗和预防肿瘤复发的目的。由于多数研究选用的抗原位点均为scFv、VH、CDR3等，目前研究的主要方向集中在如何提高免疫原性，增强抗独特型免疫反应上。 本研究选用来源于人B细胞淋巴瘤临床活检标本和人B细胞淋巴瘤Namalwa细胞系的独特型基因片段作为抗原基因构建DNA疫苗，更贴近于临床应用。为加强独特型抗原的免疫原性，本研究克隆小鼠趋化因子MCP-3作为免疫佐剂分子，分别与scFv、VH、CDR3三种独特型抗原基因融合构建DNA疫苗。在前人基础上，我们所构建的MCP-CDR3和MCP-VH均为新的疫苗方案，探讨这两种独特型DNA疫苗在小鼠体内诱导特异性抗独特型免疫反应的效果有无差异，并且比较三种疫苗在构建和制备方面的优缺点。这对于独特型DNA疫苗治疗B细胞淋巴瘤的临床应用是必须的。 本研究首先通过RT-PCR方法扩增人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa免疫球蛋白重链可变区和临床活检组织细胞免疫球蛋白重链和轻链可变区序列。将活检组织细胞的VH和VL用15aa的连接片段组装为scFv片段。通过DNA比对分析，确定Namalwa免疫球蛋白重链可变区中互补决定区3(CDR3)序列，以PCR的方法对所确定的CDR3序列进行修饰以摘要利于重组PCR。MCP一3完整cDNA同样修饰后与CDR3序列中间以saa的连接片段通过重组PCR的方法融合在一起作为抗原基因片段，DNA疫苗。以同样的策略构建分别含有MCP3一NVH、MCP3一scFv因的DNA疫苗。构建融合基 随后将所构建的三种基因重组表达载体大量提取和纯化。通过体外瞬时转染结合RT一PCR方法证实这三种重组表达质粒均能够在真核细胞中正确表达。将三种DNA疫苗分别免疫小鼠，共分4组:第1组注射peDNA3 .lzMeP一CDR3质粒;第2组注射peDNA3，1/MeP一NvH质粒;第3组注射PcDNA3 .l/MCP一scFv质粒;第四组为对照组，注射空载体质粒PcDNA3.1。免疫方法为每只小鼠每两周肌肉注射一次，共3次，每次注射相应质粒IOOug。首次免疫及初免后第6、8、10、14、17及20周，鼠尾采血采用流式细胞术检测小鼠抗体生成情况，并用LDH释放法测定CTL活性以检测抗独特型的细胞免疫反应。 DNA疫苗免疫组小鼠免疫后，CDR3组和VH组5只免疫小鼠各有3只产生抗体，:cFv组5只小鼠有4只产生抗体。初次免疫后第6周小鼠体内特异性抗独特型抗体与对照组以及免疫前没有明显差异，第8周开始抗体滴度明显升高，并且维持高水平至第20周。而且三种疫苗的效果类似，CDR3组和VH组两者之间无显著性差异。特异性检测发现三种疫苗所诱导的抗体只特异性识别肿瘤细胞表面独特型抗原，而不识别人A549对照细胞。以乳酸脱氢酶释放法证明没有发现明显的细胞免疫反应的产生。上述结果表明，这三种DNA疫苗都可以诱导小鼠产生抗淋巴瘤细胞的独特型特异性抗体，且CDR3组和VH组两者之间没有明显差异。人源CDR3仅仅作为抗原结合区的一部分，在小鼠体内诱导抗人Ig非特异性抗体的可能性很小，虽然VH和scFv有可能诱导产生鼠抗人19抗体，但是本研究结果显示CDR3所诱导的识别Namalwa细胞的抗体滴度以及抗体持续时间方面与VH组没有差异，这充分证明了MCP一3融合的CDR3作为抗原基因摘要5用于DNA疫苗所起的效果与VH相同。另外从实验技术的优化和实际应用的角度讲，相对于复杂的长片段ScFv，以CDR3为特异性抗原基因的DNA疫苗由于序列较短，不易引起碱基突变等问题，而且应用安全性较高，更有利于临床实际应用。另外，辅以MCP一3的趋化作用后，CDR3抗原基因能够诱导出与经典的ScFv类似的抗体反应结果，值得进一步深入研究。 综上所述，我们成功构建了3种来源于人B细胞淋巴瘤肿瘤细胞的DNA疫苗，分别是PeDNA3.l/MCp一CDR3、peDNA3.1/MCP一NVH、PcDNA3 .1/McP一ScFv质粒。用其免疫动物后可诱导出特异性抗肿瘤细胞的免疫反应，证明以CDR3为特异性抗原基因的DNA疫苗足以诱导抗独特型免疫反应，为将来研究其DNA疫苗治疗B细胞恶性淋巴瘤的研究打下理论基础。