【摘 要】
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电穿孔转染法是目前用于制备转基因生物和研究真核细胞基因功能的可靠方法,具有重复性强、操作方便、适用的细胞种类广泛等优点,原则上通过优化电参数任何细胞都可能获得较高的转染效率。但是相关研究多集中在哺乳动物细胞,在体外条件下电转染鱼类细胞的报道较少。鱼类怀卵量大但成熟卵在体外条件下没有良好的保存环境,因此对鱼卵进行体外操作时常受限。由于电转染效率受电参数、质粒浓度、细胞类型等多种因素影响,如何优化电转
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电穿孔转染法是目前用于制备转基因生物和研究真核细胞基因功能的可靠方法,具有重复性强、操作方便、适用的细胞种类广泛等优点,原则上通过优化电参数任何细胞都可能获得较高的转染效率。但是相关研究多集中在哺乳动物细胞,在体外条件下电转染鱼类细胞的报道较少。鱼类怀卵量大但成熟卵在体外条件下没有良好的保存环境,因此对鱼卵进行体外操作时常受限。由于电转染效率受电参数、质粒浓度、细胞类型等多种因素影响,如何优化电转染条件,以获得较好的转染效果,是电穿孔技术在研究应用上最为关键的问题。本研究以鲫尾鳍细胞和斑马鱼成熟配子为研究对象,对电转染条件以及鱼类成熟卵的体外暂存方法进行了初步探索。主要研究结果如下:1、GFP和RFP荧光报告质粒是为转染哺乳动物细胞的质粒表达载体,为验证两种荧光报告质粒是否能够在鱼类中表达,利用显微注射技术将两种荧光报告质粒分别注射到斑马鱼一细胞时期的胚胎,24h后在荧光显微镜下观察到有强荧光表达的阳性胚胎,表明两种荧光报告质粒都能在鱼类中有效表达。2、为建立鱼尾鳍细胞电转染方法,通过电穿孔技术用GFP荧光报告质粒转染体外培养的鲫尾鳍细胞,并从电压、脉冲次数、质粒浓度等方面摸索鱼类尾鳍细胞电转染条件。结果表明,电压60-70v、脉冲次数1-2、脉冲长度55ms（电容1100μF,电阻50Ω）、1mm电极杯、质粒浓度500 ng/μl,细胞转染效率可达70%。3、为延长鱼类成熟卵的体外操作时间,探索了鱼类成熟卵的体外暂存方法,自主研制了一种鱼类成熟卵体外暂存液,其配方为68.25%基础培养液+1.75%鲤鱼血清+30%鱼卵巢液,p H=8.1。结果表明斑马鱼成熟卵在上述暂存液中保存30min再体外受精的胚胎存活率为90%。通过显微镜和扫描电镜对胶膜形态结构的观察结果显示:斑马鱼成熟卵在暂存液保存30min后形态及结构基本稳定,胶膜厚度和外表面壁孔大小与未经处理的卵一致,而水激活的卵的胶膜变薄且外表面壁孔明显增大。4、利用电穿孔法分别将RFP和GFP荧光报告质粒转染到斑马鱼精子和成熟卵,初步摸索鱼类配子的电转染条件。在场强600～1000v/cm,脉冲时间20ms,脉冲次数4,脉冲间隔1s的条件下电转染斑马鱼精子,并进行体外受精,观察到部分发红色荧光的类似嵌合体的胚胎。然而,在探索斑马鱼成熟卵电转染条件的过程中,尚未观察到有荧光表达的阳性胚胎。综上所述,本研究初步优化出了适合鱼类体外培养尾鳍细胞的电转染条件,可使细胞转染效率达70%;自主研制了鱼类成熟卵的体外暂存液;初步探究了波形、电压、脉冲数、脉冲时间等因素对鱼类雌雄配子体外受精后胚胎存活率的影响。相关研究为进一步提高鱼类细胞转染效率和基因修饰鱼的创制提供了一种技术途径。
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